Larvenringdrüsendissektion: Isolierung von entwicklungsbedingten endokrinen Organen aus Drosophila

Zusammenfassung

Quelle: Imura, E., et al. Protokolle zur Visualisierung steroidogener Organe und ihrer interaktiven Organe mit Immunfärbung in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video beschreibt die Drosophila-Ringdrüse, eine komplexe endokrine Struktur, die für die Biosynthese und Sekretion von Ecdysteroiden und anderen Hormonen wichtig ist. Das vorgestellte Protokoll demonstriert die Dissektion, Fixierung und Immunfärbung.

Protokoll

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Imura et al., Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

HINWEIS: Das Gesamtschema der Protokolle ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Die Dissektion der Larvenringdrüse (RG)

HINWEIS: Bei D. melanogaster, der zu den cyclorrhaphous Diptera gehört, befindet sich das PG in einem zusammengesetzten endokrinen Organ, das als Ringdrüse bezeichnet wird (RG, Abbildung 2D). Da es nicht möglich ist, das PG chirurgisch von anderen Zelltypen zu trennen (siehe unten), besteht ein praktisches Ziel darin, ein intaktes, unbeschädigtes RG durch Dissektion zu isolieren.

1. Vorbereitung der Larven in den entsprechenden Entwicklungsstadien
   HINWEIS: Um die Entwicklungsstadien der Larven von D. melanogaster zu synchronisieren, ist es notwendig, die Eier innerhalb eines engen Zeitfensters zu sammeln und die Larven zu den entsprechenden Zeitpunkten zu sammeln.
   1. Die Eier 2 h auf einer Traubensaft-Agar-Platte bei 25 °C sammeln.
   2. Sammeln Sie frisch geschlüpfte Larven des 1^. Stadiums unter einem Präpariermikroskop mit Pinzette und geben Sie sie in ein kleines Fläschchen mit püriertem Standard-Hefe-/Maismehlfliegenfutter.
      HINWEIS: Das Alter der Larven wird durch "Stunden nach der Eiablage (hAEL)", "Stunden nach dem Schlüpfen (hAH)" oder "Stunden nach L3-Ekdysis (hAL3E)" dargestellt.
   3. Sammeln Sie die in der Sorte befindlichen Larven zum richtigen Zeitpunkt mit einer Einweg-Plastikschlaufe, um unerwünschte Verletzungen zu vermeiden. Um einen Unterschied im Entwicklungsverlauf der Larven des 3^. Stadiums zu minimieren, sammeln Sie die Larven des 2^. Stadiums bei 70 hAEL (48 hAH) und lassen Sie sie in 2-Stunden-Intervallen häuten. Sammeln Sie dann die Larven des 3^. Stadiums innerhalb von 2 Stunden nach der L3-Ekdysis; Dieses Verfahren ergibt 0-2 hAL3E-Larven.
   4. Setzen Sie die in Stadien befindlichen Larven in eine mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllte Schale.
   5. Spülen Sie die Larven mit PBS aus, um Speisereste aus dem Körper zu entfernen.
2. Grobe Dissektion von Larven unter dem Präpariermikroskop
   1. Halten Sie den Maulhaken einer Larve mit einer Pinzette. Schneiden Sie den Larvenkörper am vorderen Drittel der Körperlänge mit einer Mikroschere ab.
   2. Halten Sie das abgeschnittene Ende des vorderen Larvenkörpers mit einer Pinzette fest. Schieben Sie mit der anderen Pinzette die Spitze des Kopfes vorsichtig in Richtung Innenseite des Körpers; Durch dieses Verfahren wird der Larvenkörper auf links gekehrt.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann für die Sektion von Larven des 1^. Stadiums übersprungen werden.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1-1.2.2 mit weiteren Larven für 5-10 min.
      HINWEIS: Die Anzahl der Larven sollte gleich oder kleiner als 20 sein, um Zeit für die Sektion zu sparen.
3. Fixierung und Färbung von Gewebe mit Immunhistochemie
   1. Das vordere Drittel der Larvenkörper (Schritt 1.2.2) wird in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen gegeben, das mit 500 μl Fixlösung (4 % Paraformaldehyd in PBS) gefüllt ist. Fixieren Sie weniger als 20 Proben auf einmal, da sonst PBS, das an die fixierten Proben gebunden ist, eine ungünstige Verdünnung des Fixiermittels verursachen kann. Für die Filetdissektion entfernen Sie einen Tropfen PBS und fügen Sie dann einen Tropfen Fixlösung hinzu.
      HINWEIS: Für die fixe Lösung kann entweder 3,7 % Formaldehyd oder 4 % Paraformaldehyd verwendet werden.
   2. Inkubieren Sie das präparierte Gewebe in der fixen Lösung für 30 min bei Raumtemperatur (RT) oder alternativ für 2 h bei 4 °C.
   3. Ersetzen Sie die Fixlösung durch 500 μL PBS und spülen Sie die Proben 3 Mal schnell aus. Waschen Sie die Proben mit 500 μL 0,3 % PBT (PBS + 0,3 % Octylphenolethoxylat) für 15 min auf einer Wippe bei RT. Für die Filetdissektion entfernen Sie die Insektenstifte und geben die Proben in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen.
      HINWEIS: Um die Permeabilität von Antikörpern in das Gewebe zu erhöhen, werden die Proben mit 500 μL 2,0% PBT für 1-2 h auf einer Wippe bei RT behandelt.
   4. PBT durch 500 μl Blockierungslösung ersetzen (2 % Rinderserumalbumin in PBT). Inkubieren Sie die Proben 1,5 h lang auf einer Wippe bei RT.
   5. Ersetzen Sie die Blockierungslösung durch 50 μL der primären Antikörperlösung, d. h. Antikörper, die in der Blockierungslösung verdünnt sind.
   6. Inkubieren Sie die Proben über Nacht auf einer Wippe bei 4 °C.
   7. Ersetzen Sie die primäre Antikörperlösung durch 500 μl 0,3 % PBT und spülen Sie die Proben 5 Mal schnell aus. Waschen Sie die Proben 3 Mal mit 500 μL 0,3 % PBT für jeweils 15 min auf einer Wippe bei RT.
   8. 0,3 % PBT durch 50 μl Sekundärantikörperlösung ersetzen (Farbstoffkonjugierte Antikörper, die in der Blockierungslösung verdünnt werden). Für die Kernfärbung werden 0,5 μl 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 0,1 mg/ml Stammlösung) zu 50 μl Lösung gegeben. Inkubieren Sie die Proben auf einer Wippe für 2 h bei RT oder alternativ bei 4 °C über Nacht.
      HINWEIS: Bewahren Sie die Proben im Dunkeln auf.
   9. Ersetzen Sie die Antikörperlösung durch 500 μl 0,3 % PBT und spülen Sie sie 5 Mal aus. Waschen Sie die Proben 3 Mal mit 500 μL 0,3 % PBT für jeweils 15 min bei RT.
4. Feindissektion des Gehirn-RG-Komplexes, der das PG und die Montage enthält
   1. Verwenden Sie eine Einwegpipette, um die immungefärbten Proben in eine mit 0,3 % PBT gefüllte Schale zu überführen
      HINWEIS: Um unangenehme Blasenbildung beim Präparieren und Einbetten zu vermeiden, können 0,3 % PBT durch PBS ersetzt werden.
   2. Halten Sie unter einem Präpariermikroskop die Nagelhaut- oder Mundhaken mit einer Pinzette. Schneiden Sie mit einer 27-G-Nadel, die als "Messer" an einer 1-ml-Spritze befestigt ist, die vordere Spitze der Speiseröhre und der Augenscheiben ab, um den Gehirn-RG-Auge-Bandscheiben-Komplex aus der Schuppenschicht des Körpers zu entfernen.
   3. Trennen Sie die Speiseröhre und den Darm mit einer Pinzette vom Gehirn-RG-Auge-Bandscheiben-Komplex. Da die Speiseröhre oberhalb des ventralen Nervenstrangs (VNC) durch das Gehirn verläuft, ziehen Sie den Darm zur hinteren Seite heraus.
      HINWEIS: Um zusätzliche imaginäre Scheiben aus den Proben zu entfernen, schneiden Sie mit einem Nadelmesser die Verbindungen zwischen Gehirn, Augenscheiben und Beinscheiben durch.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.1 bis 1.4.4 für andere Proben.
      HINWEIS: Um zu verhindern, dass Gewebereste an den Proben haften bleiben, geben Sie jede fertige Probe in eine andere, saubere Schale, die mit 0,3 % PBT oder PBS gefüllt ist.
   5. Übertragen Sie die Proben mit einer Mikropipette in die Mitte eines sauberen Objektträgers.
      HINWEIS: Bei Larven des 2^. oder 3^. Stadiums sollte das Ende einer Mikropipettenspitze mit einer Rasierklinge abgeschnitten werden.
   6. Richten Sie die einzelnen Proben unter einem Präpariermikroskop mit einer Pinzette mit der Rückenseite nach oben aus.
      HINWEIS: Das RG befindet sich auf der dorsalen Seite des Gehirns (Abbildung 2A). Diese Ausrichtung erleichtert die Spezifizierung einzelner Proben während der Bildgebung.
   7. Kippen Sie einen Objektträger und wischen Sie so viel überschüssiges PBT wie möglich ab. Geben Sie einen Tropfen Einbettreagenz auf eine Seite des Objektträgers. Platzieren Sie den Rand eines Deckglases von der anderen Seite des Tropfens und legen Sie das Deckglas langsam mit einer Pinzette auf die Proben.
      HINWEIS: Dieses Verfahren verhindert, dass sich die Proben außerhalb des Deckglases bewegen.
   8. Lagern Sie die Proben bei 4 °C. Bewahren Sie die Proben im Dunkeln auf.

Ergebnisse

Abbildung 1: Das Gesamtschema der Protokolle. Je nach Zweck der Versuche sind zwei unterschiedliche Präpariermethoden auf Larven und adulte Weibchen anwendbar. Die Montagemethoden werden ebenfalls entsprechend den Probenbedingungen entwickelt. Fixations-, Färbe- und bildgebende Verfahren sind grundsätzlich allen Proben gemeinsam. ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Sammlung von Eiern
Gewebekulturschale (55 mm)	ALS EINHEIT	Tel.: 1-8549-02	für Traubensaft-Agarplatten
Auffangbecher	HIKARI KAGAKU
Hefepaste	Orientalische Trockenhefe, Tokio
100% Traubensaft	Welch Food Inc.
Aufzucht von Larven
kleine Fläschchen (12ml, 40×23,5 mm, PS)	SARSTEDT	58.487
Einweg-Schlaufe	ALS EINHEIT	Tel.: 6-488-01
Standard-Fliegenfutter			Das Rezept ist auf der Website des Bloomington Stock Centers zu finden.
Dissektion
Präpariermikroskop	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
Präpariermikroskop	Leica	S8 AP0
Gewebekulturschale (35 x 10 mm, unbehandelt)	IWAKI	Nr. 1000-035
Sylgard	TORAY		Coarting von Silikon in Schalen
Terumo Nadel (27G, 0,40 x 19 mm)	TERUMO	NN-2719S	Ein "Messer" zum Schneiden des Gewebes
Pinzette, Inox, #5	Dumont, Schweiz
Insektenstift (0,18 mm Durchmesser)	Marke Shiga		zum Sezieren von Kehlen
Mikro-Schere	NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.	MB-50-10
Fixierung
Reinstwasser	Merck Millipore
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)
Formaldehyd	Nacalai tesque	Nr. 16222-65
Paraformaldehyd	Nacalai tesque	Tel.: 02890-45
Triton-X100	Nacalai tesque	35501-15
Mikroröhrchen (1,5 ml)	INA OPTIKA	CF-0150
Inkubation
Als ein Swist-Mischer TM-300 (Wippe)	Als Einheit	TM-300	Wippe
Rinderserumalbumin	Sigma	Artikel-Nr.: 9048-46-8
Primärer Antikörper
Anti-Sro (Versuchskaninchen), 1:1000
Anti-GFP (Kaninchen), 1:1000	Molekulare Sonden	Nr. A6455	Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
Anti-GFP (Maus mAb, GF200), 1:100	Nakarai tesque	Tel.: 04363-66
anti-5HT (Kaninchen), 1:500	Sigma	Nr. S5545
anti-Hts 1B1 (Maus)	Entwicklungsstudien Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
Anti-DE-Cadherin (Ratte), 1:20	DSHB	DCAD2
Anti-NC82 (Maus), 1:50	DSHB	NC82
Sekundärer Antikörper
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 Konjugat	Lebenstechnologien	Nr. A-11008
Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 Konjugat	Lebenstechnologien	Nr. A-11001
Ziegen-Anti-Ratten-IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 546 Konjugat	Lebenstechnologien	Nr. A-11081
Ziegen-Anti-Meerschweinchen-IgG (H+L)-Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555-Konjugat	Lebenstechnologien	Nr. A-21435
Alexa Fluor 546 Farbstoff-konjugiertes Phalloidin	Lebenstechnologien	Nr. A-22283
Reagenzien einbinden
Mikro-Diaglas	Verifizierter Lieferant - Matsunami Glass Ind., Ltd.	SS7213
Quadratisches Mikroskop-Deckglas	Verifizierter Lieferant - Matsunami Glass Ind., Ltd.	C218181
FluorSave Reagenz (Einbettreagenz)	Calbiochem	345789
Transferpipette 1 ml (Einwegpipette)	Watson	5660-222-1S
Fliegen-Aktien
w; GMR45C06-GAL4			aus dem Bloomington Drosophila Stock Center. Elektronikartikel (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP			Geschenke von K. Ito, Universität Tokio.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4			Li, H. H. (2014) und Alekseyenko, O. V., Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010)
w; UAS-mCD8::GFP			aus dem Bloomington Drosophila Stock Center. Elektronikartikel (#32188)
yw;; nSyb-GAL4			aus dem Bloomington Drosophila Stock Center. Elektronikartikel (#51941)