Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Chattopadhyay et al., Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2012).
1. Lokaler Wärmesonden-Assay
Wir geben einen schädlichen thermischen Reiz an ein einzelnes Larvenkörpersegment ab, indem wir eine speziell angefertigte Wärmesonde verwenden, die von Pro-Dev Engineering hergestellt wurde (siehe Materialtabelle). Obwohl dieser Fühler über optimale Konstruktionsmerkmale verfügt (eine kleine Metallspitze von ~ 0,07 mm2 Fläche und die Fähigkeit, eine Solltemperatur von 23 °C bis 65 °C präzise einzuhalten), sollte im Prinzip jedes Werkzeug mit einer kleinen Spitze, das für einen Zeitraum von bis zu 20 Sekunden auf eine definierte Temperatur erhitzt werden kann, ausreichend sein. Die Sondenspitze wird zur Stimulation von Larven im frühen 3. Stadium genau an der dorsalen Mittellinie am Abdominalsegment A4 verwendet (siehe Abbildung 1). Als Reaktion auf diesen thermischen Reiz zeigen die Larven in der Regel ein aversives Rückzugsverhalten, bei dem sie sich um 360 Grad oder mehr seitlich rollen. Dieses Verhalten unterscheidet sich von ihrer leichten Berührungsreaktion auf eine nicht schädliche Metallsonde bei Raumtemperatur, die im Allgemeinen eine kurze Pause in ihrer Bewegungsaktivität beinhaltet.
Protokoll für den Wärmesonden-Assay:
- Voreingestellte Temperatur der Thermosonde auf den gewünschten Sollwert.
- Verwenden Sie einen Pinsel oder eine Pinzette, um eine einzelne Larve vorsichtig auf eine flache Plattform zu bringen (wir verwenden normalerweise ein kleines Stück Vinyl, das aus einem Binder geschnitten wird), auf dem die Larven anschließend stimuliert werden. Die Larve sollte vor dem Kontakt mit der Thermosonde mit einem dünnen Wasserfilm bedeckt sein. Der Wasserfilm, der die Larve bedeckt, sollte so gering wie möglich sein und die Larve vollständig bedecken, wobei darauf zu achten ist, dass die Larve beim Berühren des Vinyls nicht trocken wird.
- Drücken Sie die Sondenspitze vorsichtig gegen die Larve am Segment A4 und üben Sie leichten Druck aus, wobei die Spitze in einem Winkel von etwa 45° zwischen der Sonde und der Larvenoberfläche steht (siehe Abbildung 1). Der Druck sollte eine leichte Vertiefung auf der Oberfläche der Larve verursachen und reicht in der Regel aus, um die Fortbewegung zu verhindern. Wenn sich die Larve weiter bewegt, üben Sie etwas mehr Druck aus und sie hört normalerweise auf. Es werden keine Daten von Larven aufgezeichnet, die sich außerhalb des Sichtfeldes bewegen oder bei denen ein ständiger Sondenkontakt bis zum Ansprechen oder Erreichen der 20-s-Grenze nicht erreicht werden kann.
- Setzen Sie die Stimulation der Larve fort, bis eine Entzugsreaktion auftritt oder bis der Grenzwert von 20 Sekunden erreicht ist, je nachdem, was zuerst eintritt. Reagierende Larven zeigen in der Regel zunächst ein vorläufiges Verhalten des Anhebens von Kopf und Schwanz. Daran schließt sich in der Regel das Rückzugsverhalten von mindestens 360 Grad ab. Nur eine vollständige Rolle von 360 Grad wird als geräuschvolles Verhalten gewertet (das vorläufige Kopf- oder Heckheben ist es nicht).
- Sobald das Abhebungsverhalten initiiert wurde, geben Sie den Kontakt mit dem Test frei und zeichnen Sie die Latenz oder die Zeit bis zur Entnahme auf. Wird innerhalb von 20 Sekunden kein Entzugsverhalten beobachtet, dann ist die Larve ein Non-Responder. Die Responder lassen sich weiter in 2 Kategorien einteilen. Zeigt sich das Entzugsverhalten innerhalb von 5 Sekunden, dann ist die Larve ein Schnellansprecher. Zeigt sich das Entzugsverhalten zwischen 5-20 Sekunden, dann reagiert die Larve langsam (siehe Abbildung 1 in Babcock et al., Curr. Biol. (2009)).
