Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Liu et al. Ein Temperaturgradienten-Assay zur Bestimmung der thermischen Präferenzen von Drosophila-Larven, J. Vis. Exp. (2018).
1. Einstellung des Temperaturgradienten
- Vorbereiten eines unidirektionalen Gradienten
- Um während der Assays eine feuchte Umgebung zu schaffen, legen Sie die beiden Aluminiumblöcke, die mit zwei Wasserbädern verbunden sind, im Abstand von 10 cm auf feuchte Papiertücher (Abbildung 1A).
- Schalten Sie die beiden Wasserbäder ~2 h vor Beginn des Assays ein, um genügend Zeit zu haben, damit sich die Temperatur der Aluminiumblöcke ausgleichen kann.
HINWEIS: Es wird empfohlen, ein Scheinexperiment durchzuführen, um die Temperatur jedes Wasserbads zu bestimmen, die erforderlich ist, um den gewünschten linearen Temperaturgradienten zu erreichen. Einige typische Temperaturpaare zum Einstellen der Wasserbäder sind in Tabelle 1 aufgeführt. Beachten Sie jedoch, dass die Oberflächentemperaturen von der Umgebungstemperatur beeinflusst werden. Auch die Länge der Schläuche wirkt sich auf die Temperaturen aus, da die Schläuche abkühlen. Die Länge der Schläuche in unserem Setup beträgt 1,5 m.
- Mikrowelle 100 ml mit 1 % Agarose bei hoher Leistungsstufe in eine runde 500-ml-Weithalsflasche und 25 ml/Assay-Platte auf eine ebene Tischplatte gießen. Bereiten Sie zwei Assay-Platten vor, die gleichzeitig auf die Aluminiumblöcke aufgesetzt werden können (Abbildung 1A).
- Nachdem die Agarose fest geworden ist (10-20 min), reiben Sie jede Agaroseoberfläche vorsichtig mit einem handelsüblichen Küchenschwamm oder einem Melaminschwamm ab, um die Agaroseoberfläche leicht grob zu machen, so dass beim Besprühen des Agarosegels mit Wasser eine glatte, dünne Wassermembran entsteht und sich keine Wassertröpfchen bilden.
- Tauchen Sie die Platten vollständig in einen Behälter mit destilliertem Wasser, bis der Assay bereit ist, um ein Austrocknen der Platten zu verhindern.
- Vorbereiten eines bidirektionalen Gradienten (optional)
- Um während der Assays eine feuchte Umgebungsumgebung zu schaffen, legen Sie drei Aluminiumblöcke im Abstand von 8 cm (Abbildung 1B) auf feuchte Papiertücher.
- Schalten Sie die beiden Wasserbäder ~2 h vor Beginn des Assays ein, um genügend Zeit zu haben, damit sich die Temperatur der Aluminiumblöcke ausgleichen kann.
HINWEIS: Es wird empfohlen, ein Scheinexperiment durchzuführen, um die Temperatur jedes Wasserbades für den bidirektionalen Gradienten zu bestimmen. Einige typische Temperaturpaare zum Einstellen der Wasserbäder sind in Tabelle 2 aufgeführt. Beachten Sie jedoch, dass die Oberflächentemperaturen von der Umgebungstemperatur beeinflusst werden. Auch die Länge der Schläuche wirkt sich auf die Temperaturen aus, da die Schläuche abkühlen. Die Länge der Schläuche in unserem Setup beträgt 1,5 m.
- Um zu verhindern, dass die Agarose aus der Platte austritt, wickeln Sie die Kanten der Aluminiumplatte mit Beschriftungsband zu einer 10 mm hohen Wand ein (Abbildung 1B).
- Mit der High-Power-Einstellung 200 mL mit 1 % Agarose in einer runden 500-mL-Weithalsflasche in die Mikrowelle stellen und 120 mL auf eine Testplatte gießen.
- Nachdem die Agarose fest geworden ist (~30 min), reiben Sie jede Agarose-Oberfläche vorsichtig mit einem handelsüblichen Küchenschwamm oder einem Melaminschwamm ab, um die Agarose-Oberfläche leicht grob zu machen, so dass beim Besprühen des Agarose-Gels mit Wasser eine glatte, dünne Wassermembran entsteht und sich keine Wassertröpfchen bilden.
- Tauchen Sie die Assay-Platten vollständig in einen Behälter mit destilliertem Wasser, bis der Assay bereit ist, um ein Austrocknen zu verhindern.
- Einrichten eines unidirektionalen Gradienten
- Bereiten Sie die Reagenzien und Gegenstände auf einer Bank neben dem Gradientenassay-Gerät vor (siehe Materialtabelle).
- Um eine effiziente Temperaturübertragung zu fördern, füllen Sie alle Lücken zwischen den Aluminiumblöcken und den Testplatten, indem Sie Wasser an die Grenzfläche zwischen den Blöcken und der Platte sprühen.
- Nehmen Sie die Assay-Platten mit Handschuhen aus dem Wasserbehälter. Wenn Wasser zwischen das Agarosegel und die Platte eindringt und Unebenheiten auf der Oberfläche bilden, entfernen Sie das Wasser mit einer P1000-Mikropipette.
- Platzieren Sie die Assay-Platten so auf den Aluminiumblöcken, dass die Abgrenzungen, die 2 cm von beiden Kanten entfernt sind, genau mit den Kanten der Aluminiumblöcke übereinstimmen (Abbildung 1A,C).
- Sprühen Sie Wasser auf die Oberfläche der Platte (eine dünne Wassermembran, die die Agaroseoberfläche bedeckt, reicht aus), um ein Austrocknen des Agarosegels zu verhindern. Achten Sie darauf, dass die Wassermembran durchgehend und frei von Wassertröpfchen ist, da sich Larven in Wassertröpfchen verfangen können.
- Decken Sie das Gradientensystem mit einem Karton ab, um die Wasserverdunstung zu reduzieren und die Temperatur der Geloberfläche zu stabilisieren. Warten Sie 5-10 Minuten, damit sich die Temperatur ausgleichen kann.
- Überprüfen Sie die Oberflächentemperatur an 12 Punkten auf der Platte (Abbildung 1C). Führen Sie innerhalb jeder Zone zwei Messungen durch, um festzustellen, ob innerhalb einer Zone Variabilität vorhanden ist oder nicht. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur an beiden Stellen innerhalb von ± 0,2 °C der gewünschten Temperatur liegt.
HINWEIS: Eine Variabilität innerhalb einer Zone tritt in der Regel dadurch auf, dass die exakten Abstände der beiden Punkte zum Rand der Aluminiumblöcke nicht identisch sind. Passen Sie die Position der Platte auf den Aluminiumblöcken an, um sicherzustellen, dass die Abgrenzungen, die 2 cm von beiden Kanten entfernt sind, genau mit den Kanten der Aluminiumblöcke übereinstimmen.
- Wenn der gemessene Temperaturgradient vom gewünschten Gradienten abweicht, erhöhen oder verringern Sie die Temperatureinstellung(en) des Wasserbads und überprüfen Sie die Oberflächentemperatur erneut, nachdem sich die Temperatur des/der Wasserbad(e) stabilisiert hat.
- Decken Sie das Gradientensystem mit einem Karton ab, bis der Assay beginnt.
- Bidirektionalen Gradienten einrichten (optional)
- Bereiten Sie die Reagenzien und Gegenstände auf einer Bank neben dem Gradientenassay-Gerät vor (siehe Materialtabelle).
- Sprühen Sie Wasser auf die Oberflächen der drei Aluminiumblöcke, um eine effiziente Temperaturübertragung von den Aluminiumblöcken auf die Assay-Platten zu fördern, indem Sie alle Lücken zwischen den Oberflächen füllen.
- Nehmen Sie die Assay-Platten vorsichtig aus dem Wasserbehälter und legen Sie sie auf die Aluminiumblöcke. Wenn Wasser zwischen das Agarosegel und die Platte eindringt, was dazu führen kann, dass sich Unebenheiten auf der Oberfläche bilden, entfernen Sie das Wasser mit einer P1000-Mikropipette.
- Platzieren Sie die Assay-Platte so auf den Aluminiumblöcken, dass die Mittellinien der ersten und letzten Zone von beiden Kanten genau mit den Kanten der beiden seitlichen Aluminiumblöcke übereinstimmen (Abbildung 1B,D).
- Sprühen Sie Wasser auf die Oberfläche der Platte (eine dünne Wassermembran, die die Agaroseoberfläche bedeckt, reicht aus), um ein Austrocknen des Agarosegels zu verhindern. Achten Sie darauf, dass die Wassermembran durchgehend und frei von Wassertröpfchen ist, da sich Larven in Wassertröpfchen verfangen können.
- Decken Sie das Gradientensystem mit einem Karton ab, um die Wasserverdunstung zu reduzieren und die Temperatur der Geloberfläche zu stabilisieren. Warten Sie 5-10 Minuten, damit sich die Temperatur ausgleichen kann.
- Überprüfen Sie die Oberflächentemperatur an zwei Punkten entlang der Mittellinie jeder der 10 Zonen (Abbildung 1D). Führen Sie innerhalb jeder Zone zwei Messungen durch, um festzustellen, ob innerhalb einer Zone Variabilität vorhanden ist oder nicht. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur an beiden Stellen innerhalb von ± 0,2 °C der gewünschten Temperatur liegt.
HINWEIS: Eine Variabilität innerhalb einer Zone tritt in der Regel dadurch auf, dass die exakten Abstände der beiden Punkte zum Rand der Aluminiumblöcke nicht identisch sind. Passen Sie die Position der Platte auf den Aluminiumblöcken an, um sicherzustellen, dass die Mittellinien der ersten und letzten Zone, die jeder Kante am nächsten liegen, genau mit den Kanten der beiden seitlichen Aluminiumblöcke übereinstimmen.
- Wenn der gemessene Temperaturgradient vom gewünschten Gradienten abweicht, passen Sie die Temperatureinstellung(en) des Wasserbads an und überprüfen Sie die Oberflächentemperatur erneut, nachdem sich die Temperatur des Wasserbad(s) stabilisiert hat.
- Decken Sie die Blöcke bis zum Beginn des Assays mit einem Karton ab.
2. Assay und Berechnung
- Entfernen Sie den Karton und überprüfen Sie die Oberflächentemperatur des Gels, bevor Sie die Larven auf die Platte übertragen. Minimieren Sie die Zeit, in der der Karton geöffnet ist, um eine Störung des Temperaturausgleichs zu vermeiden. Wenn die Oberfläche trocken ist, sprühen Sie eine kleine Menge Wasser auf die Oberfläche.
- Verteilen Sie 150 ± 50 Larven in der Nähe der Mitte jeder Platte (zwischen den Zonen 3 und 4 der 6 Zonen) für den einseitigen Gradienten (Freisetzungszone; Abbildung 1C).
HINWEIS: Für den bidirektionalen Gradienten verteilen Sie 200-400 Larven entlang der mittleren Zone jeder Hälfte (Abbildung 1D).
- Setzen Sie einen Mikrotiterplattendeckel über jede Testplatte, um zu verhindern, dass die Larven herauskriechen. Decken Sie das Setup mit einem Karton ab, um Lichteinwirkung zu vermeiden, die die Larvenwahl auf dem Agarosegel beeinträchtigen könnte.
HINWEIS: Für den bidirektionalen Gradienten sollte es nicht notwendig sein, die Platte mit einem Deckel abzudecken, da die Platte größer ist und die bevorzugte Temperatur der Larven in der mittleren Zone liegt. Folglich sammeln sich nur wenige Larven an den Rändern an und haben die Möglichkeit, herauszukriechen.
- Lassen Sie den Assay je nach Alter der Larven 10-30 Minuten für den unidirektionalen Gradienten und 15-35 Minuten für den bidirektionalen Gradienten fortsetzen (Tabelle 3).
- Entferne den Karton und den Mikrotiterplattendeckel. Fotografieren Sie die Platten von oben mit einer Digitalkamera. Machen Sie zwei Fotos von jeder Assay-Platte, damit der Prüfer diejenige mit besserem Kontrast und besserer Helligkeit für die Analyse auswählen kann.
- Entfernen Sie alle Larven durch Aspiration aus den Testplatten und an allen Stellen außerhalb der Platten.
- Reinigen Sie die Assay-Platten, die Röhrchen und das Zellsieb gründlich mit destilliertem Wasser. Verwenden Sie die an diesem Tag vorbereiteten Testplatten wieder, es sei denn, die Oberfläche der Agarose ist beschädigt.
- Berechnen Sie die prozentuale Verteilung der Larven in jeder Zone.
- Öffnen Sie das fotografische Bild der Assay-Ergebnisse mit einer beliebigen Software, mit der Sie dem Bild Markierungen hinzufügen können. Um die Untersuchungszonen anzuzeigen, zeichnen Sie alle 2 cm vertikale Linien, die auf den Abgrenzungen auf der Untersuchungsplatte basieren.
- Zählen Sie die Anzahl der Larven in jeder Zone und notieren Sie die Anzahl. Zählen Sie keine Larven in einem Abstand von 0,5 cm zu einer der Wände. Das Gel ist in der Nähe der Wände dicker, und die Oberflächentemperaturen sind in diesen Bereichen nicht linear.
- Berechnen Sie für die Neigung in einer Richtung die prozentuale Verteilung in jeder Zone wie folgt:
(Anzahl der Larven in einer gegebenen 2-cm-Zone)/ (Gesamtzahl der Larven in 6 Zonen) x 100.
- Berechnen Sie für den bidirektionalen Gradienten die prozentuale Verteilung in jeder Zone wie folgt:
(Anzahl der Larven in einer gegebenen 2-cm-Zone)/ (Gesamtzahl der Larven in 5 Zonen auf jeder Seite des Gradienten) x 100.
