Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Chiu et al., Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila, J. Vis. Exp.(2010).
1. Laden von Fliegen in Aktivitätsröhren und Überwachungssystem für die Bewegungsaktivität
- Schalten Sie vor dem Laden der Fliegen in die Aktivitätsröhren die Inkubatoren ein, die zur Unterbringung der Aktivitätsmonitore verwendet werden. Stellen Sie die Temperatur mit der Steuerung des Inkubators ein und stellen Sie das Hell-Dunkel-Regime mit dem Lichtregler des DAM-Systems ODER dem eigenen Lichtsteuerungssystem des Inkubators gemäß dem gewünschten Versuchsdesign ein. Die Zeit, die zum Laden der Fliegen in die Aktivitätsröhren erforderlich ist, sollte ausreichen, damit sich die Temperatur stabilisiert.
- Betäuben Sie die Fliegen mit Kohlendioxid.
- Verwende einen feinen Pinsel, um eine einzelne Fliege vorsichtig in eine Aktivitätsröhre zu übertragen.
- Nehmen Sie die Mitte eines einzelnen Garnstücks, das etwa einen halben Zoll lang ist, mit einer feinen Pinzette und führen Sie das Garn in das Non-Food-Ende des Aktivitätsschlauchs ein, um die Öffnung zu verschließen und zu verhindern, dass die Fliege während des Experiments entweicht, während Sie gleichzeitig einen Luftstrom in den Schlauch ermöglichen. Alternativ können Kunststoffkappen mit kleinen Löchern (Trikinetics, Inc.) verwendet werden, um die Öffnung zu verschließen.
- Achten Sie darauf, dass die Schläuche auf die Seite gelegt werden, bis die Fliege erwacht, sonst besteht die Gefahr, dass die Fliege am Futter hängen bleibt.
- Stecken Sie die Schläuche in die Aktivitätsmonitore. Bei den neueren, kompakteren Modellen der Trikinetics Monitore (Trikinetics DAM2 und DAM2-7) ist es notwendig, die Röhren mit Gummibändern an Ort und Stelle zu halten, um sicherzustellen, dass der Infrarotstrahl die Röhre in der Mittelposition passiert.
- Setzen Sie die Aktivitätsmonitore in die Inkubatoren ein und schließen Sie sie über die Telefonkabel an das Datenerfassungssystem an. Überprüfen Sie die Verwendung der DAM-Systemerfassungssoftware, um sicherzustellen, dass alle Monitore ordnungsgemäß angeschlossen sind und Daten von jedem von ihnen gesammelt werden. Der Monitor sendet einen Infrarotlichtstrahl über die Mitte jeder Glasaktivitätsröhre aus. Die Fortbewegungsaktivität der Fliegen wird als binäre Rohdaten aufgezeichnet, wobei jedes Mal, wenn der Infrarotstrahl unterbrochen wird, "eins" aufgezeichnet wird, oder eine "Null", bei der der Infrarotstrahl nicht unterbrochen wird.
2. Versuchsplanung zur Aufzeichnung von Daten zur Bestimmung der zirkadianen Periodizität und Amplitude
- Die Fliegen werden synchronisiert und mitgerissen, indem sie 2-5 volle Tage lang dem gewünschten Hell-Dunkel- (LD) und Temperaturregime ausgesetzt werden. Die am häufigsten verwendete Entrainment-Bedingung ist ein Hell-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden Licht / 12 Stunden Dunkelheit (12:12 LD) bei 25 °C. Dieser allgemein akzeptierten Standardbedingung beruht im Wesentlichen auf der Annahme, dass Drosophila aus afroäquatorialen Standorten stammt. Wenn man zirkadiane Rhythmen studiert, gibt es einige Phrasen, mit denen man sich vertraut machen muss. Relevant für dieses Protokoll ist die Zeit, zu der die Lichter im Inkubator angehen, als Zeitgeberzeit 0 (ZT0) definiert, und alle anderen Zeiten sind relativ zu diesem Wert (z. B. ist ZT12 in einem 12:12-LD-Zyklus die Zeit, zu der das Licht ausgeschaltet wird). Unter Standardbedingungen von 12:12 LD zeigen Wildtyp-Drosophila melanogaster typischerweise zwei Aktivitätsschübe; einer um ZT0 zentriert, der als "Morgen"-Peak bezeichnet wird, und ein anderer um ZT12, der als "Abend"-Peak bezeichnet wird (Abbildung 1A). Die morgendlichen und abendlichen Anfälle werden von der endogenen Uhr gesteuert, aber es gibt auch "Schreck"-Reaktionen, bei denen es sich um vorübergehende Aktivitätsausbrüche als Reaktion auf die Hell-Dunkel-Übergänge handelt. Zwei Tage Entrainment sind das Minimum und könnten z.B. in großen Bildschirmen eingesetzt werden, die zeitaufwändiger sind und auf die Messung von Freilaufzeiten in ständiger Dunkelheit ausgerichtet sind (siehe unten, Schritt 2). Wenn Sie jedoch daran interessiert sind, die Aktivitätsmuster während eines täglichen Hell-Dunkel-Zyklus zu untersuchen, ist es vorzuziehen, die Fliegen 4-5 Tage lang in LD zu halten, um mehr Daten zu erhalten. Im Wesentlichen führt die Erhöhung der Anzahl der Fliegen oder der Anzahl der LD-Tage in der abschließenden Datenanalyse (z. B. Pooldaten der letzten zwei Tage der LD-Bewegungsaktivität) zu zuverlässigeren Tagesaktivitätsprofilen und -messungen (z. B. Zeitpunkt des morgendlichen oder abendlichen Peaks). Darüber hinaus variiert die tägliche Verteilung der Aktivität in Abhängigkeit von der Tageslänge (Photoperiode) und der Temperatur. Ein Hauptgrund für die Abweichung der Photoperiode oder Temperatur vom Standard ist, wenn man untersuchen möchte, wie tägliche Aktivitätsmuster saisonale Anpassungen durchlaufen (z. B. Chen et al., Cold Spring, Harb, Symp, Quant Biol. (2007)). Drosophila kann auch in tägliche Temperaturzyklen eingebunden werden (z.B. Glaser und Stanewsky, Curr Biol. (2005); Sehadova et al., Neuron (2009)). Temperaturzyklen, die nur um 2-3 °C variieren, reichen aus, um den Aktivitätsrhythmus mitzunehmen.
- Der freilaufende Bewegungsrhythmus wird unter konstanten Dunkel- und Temperaturbedingungen nach Beendigung der Einschulungszeit gemessen (siehe oben, Schritt 1). Die Einstellung für den Lichtzyklus kann jederzeit in der Dunkelphase am letzten Tag der LD geändert werden, so dass der folgende Tag des Experiments den ersten Tag der DD darstellt. Sieben Tage DD-Datenerfassung sind ausreichend, um die zirkadiane Periode und die Amplitude (z.B. Stärke oder Stärke des Rhythmus) von Fliegen zu berechnen. Im Allgemeinen ist eine Stichprobengröße von mindestens 16 Fliegen notwendig, um zuverlässige Freilaufzeiten für einen bestimmten Genotyp zu erhalten. Selbst wenn man nur an der Messung der Tagesaktivität interessiert ist, ist es immer noch am besten, die Freilaufperioden der Fliegen in DD zu messen, da Änderungen in der endogenen Periode die tägliche Verteilung der Aktivität in LD verändern können. Zum Beispiel zeigen Fliegen mit langen endogenen Perioden in der Regel verzögerte abendliche Spitzen in der LD (siehe z.B. Abbildung 2).
- Am Ende des Experiments werden die mit der DAM-Systemsoftware gesammelten Binärdaten auf einen tragbaren Datenträger, z. B. einen USB-Stick, heruntergeladen.
- Die binären Rohdaten werden mit DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) verarbeitet und bei der Analyse von zirkadianen Parametern in 15- und 30-Minuten-Bins oder bei der Analyse von Schlaf-/Ruheparametern in 1- bis 5-Minuten-Bins summiert. Derzeit sind fünf zusammenhängende Minuten Inaktivität die Standarddefinition von Schlaf/Ruhe bei Drosophila (Hendricks et al., Neuron (2000); Ho und Sehgal, Methoden Enzymol., (2005)).
- Es gibt viele verschiedene Möglichkeiten, die im DAM-System gesammelten Daten zu analysieren, aber wir werden nur die Methoden zur Verfügung stellen, die routinemäßig in unserem Labor verwendet werden. Microsoft Excel wird verwendet, um den Genotyp verschiedenen Stichprobengruppen zuzuweisen. FaasX-Software (M. Boudinot und F. Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, Frankreich) oder Insomniac (Matlab-basiertes Programm; Leslie Ashmore, University of Pittsburgh, PA) werden verwendet, um zirkadiane (z. B. Periode und Leistung) bzw. Schlaf-/Ruheparameter (z. B. prozentualer Schlaf, mittlere Ruhedauer) zu untersuchen.
