Drosophila Aktivitetsmonitor (DAM): En metode for å måle lokomotorisk aktivitet i fluer

Overview

Denne videoen beskriver Drosophila activity monitor (DAM)-systemet som brukes til å spore lokomotorisk aktivitet. Forskere bruker aktivitetsdata samlet inn fra DAM for å studere døgnrytmer i fruktfluer. Det utvalgte protokollklippet viser hvordan du laster fluer i enheten og registrerer aktivitetsdata for døgneksperimenter.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Chiu et al.,som analysen av lokomotorisk aktivitet for å studere døgnrytmer og søvnparametere i Drosophila, J. Vis. Exp. (2010).

1. Lasting av fluer i aktivitetsrør og lokomotorisk aktivitetsovervåkingssystem

1. Før du laster fluer inn i aktivitetsrør, slå på inkubatorene som skal brukes til å huse aktivitetsmonitorene. Juster temperaturen ved hjelp av inkubatorkontrollene og still inn det lyse/mørke regimet ved hjelp av DAM System light controller ELLER inkubatorenes eget lyskontrollsystem i henhold til ønsket eksperimentell design. Tiden som er nødvendig for å laste fluer inn i aktivitetsrør, bør være tilstrekkelig for at temperaturen skal stabilisere seg.
2. Bedøv fluene med karbondioksid.
3. Bruk en fin pensel for å forsiktig overføre en enkelt flue til et aktivitetsrør.
4. Ta tak i midten av et enkelt stykke garn som er rundt en halv tomme med fine tang og sett garnet inn i den ikke-mat enden av aktivitetsrøret for å koble til åpningen og forhindre at flyet rømmer under eksperimentet, samtidig som luftstrømmen slippes inn i røret. Alternativt kan plasthetter med små hull (Trikinetics, Inc.) brukes til å lukke åpningen.
5. Pass på at rørene legges på sidene til flyet våkner, ellers er det fare for at flyet sitter fast i maten.
6. Sett rørene inn i aktivitetsmonitorene. Med den nyere, mer kompakte modellen til Trikinetics-skjermene (Trikinetics DAM2 og DAM2-7), er det nødvendig å holde rørene på plass med gummibånd for å sikre at den infrarøde strålen passerer røret i midtposisjon.
7. Sett aktivitetsmonitorene inn i inkubatorene og koble dem til datainnsamlingssystemet via telefonledningene. Sjekk at du bruker DAM System collection-programvaren for å sikre at alle skjermene er riktig koblet sammen og at data samles inn fra hver av dem. Skjermen avgir infrarød lysstråle over midten av hvert glassaktivitetsrør. Fluenes lokomotoriske aktivitet registreres som rå binære data der "en" registreres hver gang den infrarøde strålen brytes eller en "null" registreres der den infrarøde strålen ikke er ødelagt.

2. Eksperimentell design for å registrere data for bestemmelse av circadian periodicity og amplitude

1. Fluer synkroniseres og entraines ved å utsette dem for ønsket lys / mørk (LD) og temperaturregime i 2-5 hele dager. Den mest brukte entrainment tilstanden er en lys / mørk syklus på 12 timer lys / 12 timer mørk (12: 12 LD) ved 25 ° C. Denne allment aksepterte standardtilstanden er i hovedsak basert på tanken om at Drosophila stammer fra Afro-ekvatoriale steder. Når man studerer døgnrytme er det noe fraseologi man må bli kjent med. Relevant for denne protokollen er tiden når lysene tennes i inkubatoren definert som zeitgebertid 0 (ZT0), og alle andre ganger er i forhold til denne verdien (f.eks. i en 12:12 LD-syklus er ZT12 tiden da lysene slås av). Under standard 12:12 LD forhold, vill type Drosophila melanogaster vanligvis vise to kamper med aktivitet; en sentrert rundt ZT0 betegnet "morgen" topp og en annen rundt ZT12 betegnet "kveld" topp (Figur 1A). Morgen- og kveldskampene styres av den endogene klokken, men det er også "startle" svar som er forbigående utbrudd av aktivitet som svar på de lyse / mørke overgangene. To dager med opplæring er minimum og kan for eksempel brukes i store skjermer som er mer tidkrevende og er rettet mot å måle frittgående perioder i konstant mørke (se nedenfor, trinn 2). Men hvis du er interessert i å studere aktivitetsmønstrene under en daglig lys-mørk syklus, er det å foretrekke å opprettholde fluene i 4-5 dager i LD for å få mer data. I hovedsak vil økning av antall fluer eller antall LD-dager i den endelige dataanalysen (f.eks. utvalgsdata fra de to siste dagene med LD lokomotorisk aktivitet) generere mer pålitelige daglige aktivitetsprofiler og målinger (f.eks. tidspunkt for morgen- eller kveldstopp). Videre varierer den daglige fordelingen av aktivitet som en funksjon av daglengde (fotoperiod) og temperatur. En viktig grunn til å endre fotoperioden eller temperaturen fra standarden er om man ønsket å studere hvordan daglige aktivitetsmønstre gjennomgår sesongmessig tilpasning (f.eks. (2007)). Drosophila kan også benyttes til daglige temperatursykluser (f.eks. (2005); Sehadova et al., Neuron (2009)). Temperatursykluser som varierer med bare 2-3 °C er tilstrekkelige til å øke aktivitetsrytmene.
2. Frittgående lokomotoriske aktivitetsrytmer måles under konstante mørke og temperaturforhold etter at inntrenkingsperioden er ferdig (se ovenfor, trinn 1). Innstillingen for lyssyklusen kan endres når som helst i den mørke fasen på den siste dagen av LD slik at den påfølgende dagen for eksperimentet representerer den første dagen i DD. Syv dager med DD-datainnsamling er tilstrekkelig til å beregne døgnperioden og amplituden (f.eks. kraft eller rytmestyrke) av fluer. Generelt er en prøvestørrelse på minst 16 fluer nødvendig for å oppnå pålitelige frittgående perioder for en bestemt genotype. Selv om man bare er interessert i å måle daglig aktivitet, er det fortsatt best å måle fluenes frittgående perioder i DD, da endringer i endogen periode kan endre den daglige fordelingen av aktivitet i LD. For eksempel viser fluer med lange endogene perioder vanligvis forsinkede kveldstopper i LD (se for eksempel figur 2).
3. Ved avslutningen av eksperimentet lastes rå binære data som samles inn ved hjelp av DAM System-programvaren, ned til en bærbar datalagringsenhet, for eksempel USB-nøkkel.
4. Rå binære data behandles ved hjelp av DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) og summeres i 15 og 30 minutters skuffer når du analyserer circadian parametere, eller 1 til 5 minutters skuffer når du analyserer søvn / hvile parametere. For tiden er fem sammenhengende minutter med inaktivitet standarddefinisjonen av søvn / hvile i Drosophila (Hendricks et al., Neuron (2000); Ho og Sehgal, Metoder Enzymol., (2005)).
5. Det er mange forskjellige måter å analysere dataene som er samlet inn på DAM-systemet, men vi vil bare tilby disse metodene rutinemessig brukt i laboratoriet vårt. Microsoft Excel brukes til å tilordne genotype til forskjellige eksempelgrupper. FaasX-programvare (M. Boudinot og F. Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, Frankrike) eller Insomniac (Matlab-basert program; Leslie Ashmore, University of Pittsburgh, PA) brukes til å undersøke henholdsvis circadian (f.eks. periode og kraft) eller søvn/hvile (f.eks. prosent søvn, gjennomsnittlig hvilekamplengde).

Representative Results

Figur 1: Eduction grafer generert ved hjelp av FaasX som viser daglige lokomotoriske aktivitetsrytmer av rytmiske villtype fluer (w per⁰ fluer som bærer en per + transgene) (A og B) vs. arytmisk w per⁰ mutanter (C og D). Mannlige fluer ble holdt ved 25 °C og indusert i 4 dager i 12:12 LD (lys: mørke) sykluser etterfulgt av syv dager i DD (konstant mørke). For hver flylinje ble de lokomotoriske aktivitetsnivåene for individuelle fluer (n>32) målt i 15-minutters hyller og deretter gjennomsnittet for å få en gruppeprofilrepresentant for den linjen. A og C viser aktivitetsdataene som genereres fra gjennomsnittet av andre og tredje dag i lys/mørk syklus (LD 2-3), mens B og D viser aktivitetsdataene som genereres fra gjennomsnittet av andre og tredje dag i konstant mørke (DD 2-3). Vertikale stenger representerer aktiviteten (i vilkårlige enheter) registrert i 15-minutters skuffer i lysperioden (lysegrå) eller den mørke perioden (mørkegrå). Horisontale stenger nederst i LD-eduksjonsgrafer; hvit, lyser på; svart, lyser av. ZT0 og ZT12 representerer henholdsvis start og slutt på fotoperioden. For DD-eduksjonsgrafer; CT0 og CT12 representerer starten og slutten på den subjektive dagen under konstante mørke forhold, betegnet med den grå linjen. I panel A, M = morgentopp; E = kveldstopp. Pilene i panel A representerer forventningsfull oppførsel av morgen- og kveldstopper observert i vill type fluer, som er fraværende i w per⁰ arytmiske fluer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Dobbeltplottshandlingogram generert ved hjelp av FaasX-programvaren som illustrerer lokomotoriske aktivitetsdata for fluer med vill type, kort eller lang periode. Mannlige fluer ble holdt ved 25 °C og indusert i 4 dager i 12:12 LD-sykluser etterfulgt av åtte dager i konstant mørke (DD) for beregning av frikjøringsperioden (t) ved hjelp av Cycle-P i FaasX. Tre flylinjer med wild-type periode [w per⁰; per+; per⁰ mutantbæring per+ transgene], lang periode [w per⁰; per(S47A); per⁰ mutantbæring per (S47A) transgene], og kort periode [w per⁰; per(S47D); per⁰ mutantbæring per (S47D) transgene] er vist her (Chiu et al. 2008). X-aksen representerer ZT- eller CT-tid i henholdsvis LD eller DD, og Y-aksen representerer aktivitetsantall (vilkårlige enheter) summert i 15-minutters skuffer. De røde stiplede linjene forbinder kveldstoppene for hver dag i eksperimentene. Merk at i løpet av LD er kveldstoppen "tvunget" til å opprettholde synkron med 24-timers LD-syklusen, mens i DD kan frikjøringsperioden avvike fra 24 timer. For fluer med korte perioder vil for eksempel tidspunktet for kveldsaktiviteten skje tidligere på hver etterfølgende dag i DD (når de plottes mot en 24 timers tidsskala, som vist her), mens et skifte til høyre observeres for fluer med lange perioder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	DAM2 or DAM5	DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator
Power supply interface unit (for DAM system)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PSIU9	Includes PS9-1 AC Power Supply
Light controller	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	LC6
Pyrex glass tubes	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PGT5, PGT7, and PGT10
Plastic activity tube caps	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	CAP5	Yarn can be used instead of plastic caps.
DAM System data collection software	Trikinetics Inc.; Waltham, MA		Versions available for both Mac and PC
FaasX software	Centre National de la Recherche Scientifique		Only for Mac
Insomniac 2.0 software	University of Pittsburgh School of Medicine		Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh.
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit)	APC	SU2200NET	Output Power Capacity of 1600 Watts
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
TissuePrep Paraffin pellets	Fisher Scientific	T565	Melting point 56 °C-57 °C
Block heater	VWR international	12621-014