Drosophila Optogenetik: Eine Methode zur Manipulation neuronaler Schaltkreise

Zusammenfassung

Quelle: de Vries, S. E., Clandinin, T. Optogenetische Stimulation des Fluchtverhaltens bei Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2013).

Optogenetik ermöglicht die Verwendung von Licht, um Neuronen zu manipulieren, die gentechnisch so verändert wurden, dass sie spezifische Opsine exprimieren – lichtempfindliche Proteine, deren Lichtaktivierung eine Veränderung des Zustands des Neurons auslöst. Hier beschreiben wir einen optogenetischen Ansatz in Drosophila unter Verwendung des Opsins Channelrhodopsin2. Das Beispielprotokoll enthält einen Optogenetik-Assay, um die neuronalen Schaltkreise hinter dem Fluchtverhalten der Fliege zu untersuchen.

Protokoll

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus de Vries und Clandinin, Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp.(2013).

1. Channelrhodopsin-Fliegen erzeugen

1. Kreuzung UAS-ChR2 fliegt mit dem Gal4-Treiber Ihrer Wahl, wir verwenden G105-Gal4, das in Foma-1-Neuronen im Sehlappen exprimiert wird.
2. Um die Möglichkeit einer visuellen Reaktion auf die Blaulichtstimulation auszuschließen, befinden sich beide Fliegenlinien in einem w⁺norpA-Hintergrund.
3. Endergebnis: w⁺norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
4. Nachdem die adulten Fliegen sich geschlossen haben, legen Sie ausgewählte Weibchen 3 Tage lang auf frisches Futter, das mit 10 μM all-trans-Retinal (ein für ChR2 erforderlicher Co-Faktor) ergänzt und vor Licht geschützt ist, bevor Sie den Verhaltenstest durchführen.

2. 10 μM All-trans-retinal verbesserte Lebensmittel herstellen

1. Löse 100 mg all-trans-Retinal in 17,6 ml 95%igem Ethanol auf, um 20 mM Retinal herzustellen. Bewahren Sie all-trans-retinal jederzeit vor Licht geschützt auf.
2. Standard-Maismehl-Fliegenfutter in der Mikrowelle schmelzen und abkühlen lassen, bis es sich warm anfühlt.
3. Mischen Sie 50 μl 20 mM all-trans-retinal in Durchstechflaschen mit 10 ml Fliegenfutter.
4. Lassen Sie die Fläschchen abkühlen und bewahren Sie sie vor Licht geschützt auf.

3. Ausrüstung

1. Pipettenspitzen: Standard-Pipettenspitzen mit 1.000 μl werden in der Nähe der Spitze geschnitten, wodurch ein Porendurchmesser von ~2,25 mm entsteht.
2. Plattform (siehe Abbildung 1).
   1. Ein Delrin-Sockel mit den Maßen 17 cm x 25 cm wurde mit Gewindelöchern an jeder Ecke für 1/4" NPT-Kühlmittelschlauchanschlüsse konstruiert.
   2. Ein vertikaler Halter aus Delrin ist in der Mitte des Sockels angebracht. Die Gesamtabmessungen betragen 25 mm x 40 mm x 65 mm (Breite x Tiefe x Höhe). Über die gesamte Länge des Halters verläuft eine 10 mm breite Nut, an der Unterseite befindet sich eine Rändelschraube. An der Oberseite des Halters ist eine Plattform von 25 mm x 40 mm x 10 mm angebracht, mit einem Loch mit einem Durchmesser von 3,5 mm, das mit der Nut im Halter ausgerichtet ist.
3. LED-Arrays (siehe Abbildung 1).
   1. Vier Arme Kühlmittelschlauch, ~18 cm lang, werden mit dem Kühlmittelschlauchanschluss an der Plattformbasis befestigt. Der Kühlmittelschlauch wird nur als strukturelle Stütze verwendet und wird nicht zu Kühlzwecken verwendet.
   2. Richtig verteilte Rillen werden in das letzte Stück des Kühlmittelschlauchs jedes Arms geschnitten, um einen Kühlkörper am Ende jedes Arms zu befestigen.
   3. Eine blaue LED Rebel Tri-Stars wird mit vorgestanztem Thermoklebeband an jedem Kühlkörper befestigt. An jedem Tri-Star ist eine Carclo 18° Tri-Linse angebracht.
   4. LED Tri-Stars sind mit den BuckPuck DC-Treibern und einem Netzteil wie angegeben verbunden. Wir haben unser Setup so gestaltet, dass jeder BuckPuck zwei Tri-Stars in Serie antreibt.
   5. Die Beleuchtung aller vier LED Tri-Stars bei 700 mA ergab auf unserer Plattform eine Bestrahlungsstärke von 713 W/^{m 2}.
4. Kamera: Die Kamera ist auf einem kleinen Stativ montiert und auf die Oberseite der Plattform fokussiert.

4. Verhaltens-Assay

1. Fliegen auf Eis kurz betäuben.
2. Platzieren Sie einzelne Fliegen in den Pipettenspitzen und verschließen Sie beide Enden der Spitze mit Klebeband.
3. Nachdem die Fliegen erwacht sind und aktiv die Pipettenspitze erkunden, entfernen Sie das Klebeband und platzieren Sie eine Pipette in der Rille in der vertikalen Halterung. Die Rändelschraube wird verwendet, um die Pipettenspitze zu fixieren und die Unterseite der Spitze zu verschließen.
4. Während die Fliege die Pipettenspitze erkundet (in der Regel 30 - 60 Sekunden), starten Sie die Kameraaufnahme, kurz bevor die Fliege aus der Spitze auf die Plattform kommt.
5. Nachdem die Fliege auf der Plattform aufgetaucht ist, warten Sie 1-2 Sekunden und schalten Sie die blauen LEDs ein. Verwenden Sie einen Timer, um die Zeit bis zum Start des Fluges durch die Fliege manuell zu messen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Versuchsaufbau mit der Plattform mit dem vertikalen Halter und den vier Kühlmittelschlaucharmen, die Kühlkörper mit daran befestigten LED-Arrays halten. (A) Die Aufstellung bei Umgebungsbeleuchtung. (B) Die Einrichtung, wenn die LEDs leuchten. (C) Eine Nahaufnahme einer Tri-Star-LED auf dem Kühlkörper. (D) Eine Nahaufnahme des Tri-Star mi...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenz
All-trans Retinal	Advance Scientific Chemical Inc	Nr. R3041
Ausrüstung
Kühlkörper 9,2 C/W	Luxeonstar	LPD30-30B	30 mm quadratisch x 30 mm hoch
Carclo 18° Tri-Lens	Luxeonstar	Nr. 10507
Blaue Rebellen-LED auf Tri-Star-Basis	Luxeonstar	MR-B0030-20T	470 nm, 174 lm @ 700 mA.
700 mA BuckPuck DC-Treiber	Luxeonstar	Artikel-Nr.: 3021-D-E-700
Kabelbaum für BuckPuck-Treiber	Luxeonstar	3021-HE
Vorgestanztes Thermoklebeband	Luxeonstar	LXT-S-12	20 mm Sechskantfuß
Snap-Loc Kühlmittelschlauch, 1/4" ID	McMaster-Carr	Artikel-Nr.: 5307K49
Snap-Loc Kühlmittelschlauch-Verbinder	McMaster-Carr	Artikel-Nr.: 5307K39	1/4" NPT-Außengewinde
Programmierbares DC-Netzteil in Laborqualität im Schaltmodus	BK Präzision	1698
Exilim Kamera	Casio	EX-FH20