Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Vogler und Ocorr, Visualizing the Beating Heart in Drosophila, J. Vis. Exp. (2009).
1. Bevor Sie beginnen
- Bereiten Sie eine künstliche Hämolymphlösung (AH) frisch zu, die 108 mM Na+, 5 mM K+, 2 mM Ca2+, 8 mM MgCl2, 1 mM NaH2PO4, 4 mM NaHCO3, 10 mM Saccharose, 5 mM Trehalose, 5 mM HEPES (pH 7,1, alle Reagenzien von Sigma Chemicals) enthält. Saccharose und Trehalose sollten dem AH erst kurz vor der Verwendung aus gekühlten Stammlösungen zugesetzt werden, um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden.
- Bringen Sie AH auf Raumtemperatur und sauerstoffisieren Sie die Lösung, indem Sie sie mindestens 15 Minuten lang an der Luft sprudeln lassen.
- Ziehen Sie mehrere feine Kapillaren (z.B. Glaskapillaren, 100ul, VWR), die für die Entfernung von Fett benötigt werden.
2. Halbintaktes Drosophila-Herz von der erwachsenen Fliege
- Erwachsene Drosophila-Fliegen werden mit Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) für 2-5 Minuten betäubt. Es muss darauf geachtet werden, dass die Fliegen nicht für längere Belichtungen im Fly Nap bleiben. Eine kurzfristige Kälteexposition kann auch zur Betäubung von Fliegen verwendet werden, aber CO2 wird nicht empfohlen, da es länger anhaltende Auswirkungen auf die Herzfrequenz und den Rhythmus hat.
- Betäubte Fliegen werden mit der Rückenseite nach unten in eine Petrischale gelegt, die mit einer dünnen Schicht Vaseline überzogen ist. Die hydrophobe Kutikula in den Flügeln und am Körper "klebt" reversibel an der Waalle, aber die Fliege kann bei Bedarf neu positioniert werden. Dies wird besonders wichtig bei späteren Manipulationen.
- Der erste Schnitt erfolgt mit einer gebogenen Federschere (Roboz #5611). Die Scherenklingen werden unter den Beinen platziert und in der Nähe des Halses zur dorsalen Oberfläche des Thorax abgewinkelt. Der Kopf, der ventrale Nervenstrang und die Beine werden mit einem einzigen Schnitt entfernt. Das Präparat wird dann in eine sauerstoffhaltige, künstliche Hämolymphlösung (AH) getaucht.
- Mit einer Federschere wird die hintere Bauchspitze (bestehend aus den Bauchsegmenten 7 und 8) mit einem einzigen Schnitt entfernt. Dies ermöglicht seitliche Schnitte entlang beider Bauchkanten und dient dazu, die Verbindung zwischen dem hinteren Darm und der Bauchkutikula zu durchtrennen. Anschließend wird der freiliegende Lappen der ventralen Bauchkutikula entfernt.
- In den Schritten 3 und 4 werden die vorderen und hinteren Verbindungen des Darms durchtrennt, so dass die Bauchorgane nur noch durch Tracheolen an Ort und Stelle gehalten werden. Der Darm und andere Bauchorgane können in der Regel als eine einzige Masse mit einer Juwelierzange (Roboz, #55) und leichtem Ziehen entnommen werden. Bei der Entfernung der inneren Organe kommt der schlagende Herzschlauch zum Vorschein, der noch an der dorsalen Kutikula befestigt ist, umgeben von Fettkörpern.
- Die Fettkörper sind im Lichtmikroskop recht undurchsichtig, daher ist es oft notwendig, einen Teil dieses Fettes zu entfernen, um den Herzschlauch klar sehen zu können. Dies wird durch eine Fettabsaugungstechnik mit fein gezogenen Glaskapillaren erreicht. Die Kapillaren werden mit einem Standard-Pipettenabzieher (z. B. Sutter P-97 Pipettenabzieher) hergestellt und dann in einen Kunststoffschlauch (Tygon, 1/16") eingeführt, der an einer Vakuumquelle befestigt ist. Dieses System wird verwendet, um überschüssiges Fett aus der Umgebung des Herzschlauchs abzusaugen. Die Saugkraft ist proportional zum Spitzendurchmesser, daher sollten keine Pipetten mit Spitzen mit einem Durchmesser von mehr als 40 Mikrometern verwendet werden. Es muss äußerste Vorsicht walten gelassen werden, um zu vermeiden, das Herz selbst zu berühren, und da der hintere Teil des Herzens sehr empfindlich ist, sollte dieser Bereich ganz vermieden werden.
- Der adulte Drosophila-Herzschlauch ist jetzt freigelegt und sollte schlagen. Bei Bedarf können die Nagelhaut und das daran befestigte Herz neu positioniert werden, indem die Nagelhaut vorsichtig aus der Vaseline gehoben und vorsichtig wieder festgedrückt wird, wobei wiederum jeglicher Kontakt mit dem Herzgewebe vermieden wird. Zu diesem Zeitpunkt sollte die Lösung, die das Präparat badet, durch frisches AHL ersetzt werden. Dieses Präparat sollte vor jeder Manipulation 20-30 Minuten lang mit Sauerstoffanreicherung ausgeglichen werden. Wenn das Präparat länger als 60 Minuten aufbewahrt werden soll, sollte es mit frischem AHL durchblutet werden.
