Drosophila Egg Lege-Preference Assay: Eine Methode zur Überprüfung der Entscheidungsfindung bei Fliegen

Zusammenfassung

Quelle: Gou, B., et al. Hochdurchsatz-Assay zur Untersuchung der Eiablagepräferenzen einzelner Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2016).

Drosophila-Weibchen wählen zwischen Substraten und wählen Standorte, die für die Eiablage attraktiv sind. Dieses Video beschreibt einen Verhaltensassay, der ihre Entscheidungsfindung testet, den sogenannten Eiablage-Präferenz-Assay. Der vorgestellte Clip demonstriert das Verfahren mit einem speziell angefertigten Setup, das es den Forschern nicht nur ermöglicht, das Verhalten vieler Weibchen gleichzeitig zu testen, sondern auch mit Videoaufzeichnungen und optogenetischen Setups kompatibel ist.

Protokoll

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Gou et al., High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2016).

1. Kammerbau, Montage, Assay-Aufbau

1. Lassen Sie eine Maschinenwerkstatt Acryl-Legekammern bauen (Abbildung 1A-D). Die technische Zeichnung der verschiedenen Teile ist in der ergänzenden Abbildung 1-3 dargestellt. Hochauflösende Bilder finden Sie auch hier (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
2. Legen Sie die Kunststoffplatten in das (obere) Ladestück der Kammer ein, wie in Abbildung 1C gezeigt. Dieser dient als Bodenfläche beim Verladen der Fliegen in die einzelnen Eiablagearenen.
3. Betäuben Sie die Weibchen auf einem CO₂ -Pad und laden Sie sie einzeln in jede Eiablagearena. Warten Sie ~30 Minuten für die Fliegen, um sich von dem CO_{2 zu} erholen und sich an die neue Umgebung zu gewöhnen.
4. Bereiten Sie die Agarosesubstrate vor.
   1. Bewahren Sie der Einfachheit halber eine vorgefertigte Flasche mit geschmolzener 1%iger Agarose in einem 55 °C warmen Wasserbad auf.
   2. Die gewünschte Menge Saccharoselösung (2 M) in ein konisches 50-ml-Röhrchen geben und mit einer entsprechenden Menge Agarose mischen. Um beispielsweise das 150 mM Saccharosesubstrat vorzubereiten, geben Sie 750 μl 2 M Saccharoselösung in das Röhrchen und füllen Sie dann das Röhrchen mit Agarose bis zur 10 ml-Markierung.
   3. Bereiten Sie das glatte Substrat auf die gleiche Weise vor, fügen Sie jedoch destilliertes Wasser anstelle der Saccharoselösung hinzu.
      HINWEIS: Die Endkonzentration von Agarose in diesem Protokoll beträgt etwas weniger als 1 %. Unserer Erfahrung nach spielt die genaue Konzentration von Agarose keine Rolle, solange sie innerhalb von ~0,9 - 1,1% liegt und die beiden Substrate die gleiche Agarosekonzentration aufweisen.
5. Nehmen Sie das Substratstück (unteres) Stück der Kammer und pipettieren Sie 1.000 μl Agarosesubstrat in jede Wanne, wie in Abbildung 1 D zu sehen.
6. Agarose ~30 min fest werden lassen.
7. Sobald die Agarosesubstrate und Fliegen fertig sind, setzen Sie alle drei Teile der Eiablagekammer zusammen und nehmen Sie dann die Plastikfolien heraus.
8. Stellen Sie die Kammern in Fliegenbrutschränke ein.
   HINWEIS: Die Dauer der Eiablageexperimente kann je nach experimentellem Bedarf variieren. In der Regel führen wir das Experiment O/N (14 - 16 Stunden) durch. Auch wurde kein signifikanter Einfluss des zirkadianen Timings auf die Eiablagepräferenzen beobachtet.
9. Betäuben Sie Weibchen, indem Sie CO₂ in die Kammer injizieren. Zerlege die Kammer und entsorge die betäubten Fliegen in die Leichenhalle (d.h. eine leere Kaffeedose, die mit etwas Maisöl gefüllt ist). Machen Sie Fotos von den Ergebnissen für die Aufzeichnung (siehe Abbildung 2).
10. Zählen Sie die Anzahl der Eier manuell und berechnen Sie Präferenzindizes für die Analyse. Berechnen Sie den Präferenzindex wie folgt: (N_a - N_b)/(N_a + N_b), wobei N_a und N_b die Anzahl der Eier an Ort a bzw. Standort b darstellen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Eiablagekammern und Eiablageprotokoll. (A) Vollständig montierte Eiablagekammer. (B) Zerlegte Teile. A: das Ladestück (oben), b: das Trennstück (Mitte), c: das Substratstück (unten). Technische Zeichnungen dieser Teile sind in der ergänzenden Abbildung 1-3 dargestellt. (C) Das Ladestück der Kammer. A': Schiebetüren, A": Schienen. Die Kuns...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ultrareine Agarose	Invitrogen	16500-500
Saccharose	Sigma	Nr. S0389
Wasserbad	Fischer	Artikel-Nr.: 15-462-6Q
Kammern zur Eiablage	Maßgeschneidert
Fliegenfläschchen (schmal)	Genesee	32-116 v. Chr