C. elegans Blastomer-Dissektion: Eine Methode zur Entfernung der Eierschale und zur Dissoziation embryonaler Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Hsu, C. R., et al. In vitro Rekonstitution von räumlichen Zellkontaktmustern mit isolierten Caenorhabditis elegans, Embryo-Blastomeren und selbstklebenden Polystyrol-Kügelchen.J. Vis. Exp.(2019).

Dieses Video stellt eine Methode vor, mit der C. elegans-Blastomere aus frühen Embryonen isoliert werden können. Die resultierenden Zellen eignen sich für Zellkultur- oder ex vivo-Experimente.

Protokoll

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Hsu et al., In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomere and Adhesive Polystyren Beads, J. Vis.(2019).

1. Isolierung von embryonalem Blastomer
2. Tragen Sie Handschuhe und einen Laborkittel, um Schnitte und Kontakt mit der Bleichlösung zu vermeiden.
   1. Halten Sie jedes Ende einer Mikrokapillare (Kapazität; 10 μl) mit der rechten und linken Hand fest.
   2. Ziehen Sie die Mikrokapillare zu beiden Enden, um Spannung auszuüben, und bringen Sie die Mitte der Kapillare über einen Brenner, um zwei handgezogene Kapillaren zu bilden (Abbildung 1A).
   3. Schneiden Sie die Spitzen der handgezogenen Kapillaren mit einer Pinzette unter dem Präpariermikroskop ab und befestigen Sie die gezogene Kapillare in einem Mundpipettiergerät. Bereiten Sie zwei Arten von Pipetten vor. Die Spitzenöffnungsgrößen für die Pipetten sollten etwa das 2-fache bzw. 1-fache der kurzen Achsenlänge von C. elegans-Embryonen (30 μm) für den Embryotransfer bzw. die Entfernung der Eierschale betragen (Abbildung 1B-D).
   4. Pipettieren Sie 45 μl Eisalzlösung in eine Vertiefung eines Multiwell-Objektträgers (Abbildung 2A; unten).
   5. Geben Sie 5-10 adulte C. elegans in eine Vertiefung mit Eisalzlösung.
   6. Um frühe C. elegans-Embryonen zu erhalten, schneiden Sie adulte Embryonen in Stücke, indem Sie zwei Nadeln rechts und links vom Körper von C. elegans positionieren und die Nadeln aneinander vorbeischieben (Abbildung 2A; obere Schematik).
   7. Pipettieren Sie 45 μl Hypochloritlösung in eine Vertiefung neben der Vertiefung mit der Eisalzlösung (Abbildung 2B).
   8. Pipettieren Sie 45 μl des Wachstumsmediums von Shelton in die folgenden drei Vertiefungen neben der Vertiefung mit der Hypochloritlösung (Abbildung 2B).
   9. Übertragen Sie Embryonen im 1-Zell-Stadium und im frühen 2-Zell-Stadium in die Hypochloritlösung, indem Sie mit der handgezogenen Kapillare für den Embryotransfer mundpipettieren (Abbildung 2B).
   10. Warten Sie 40–55 Sekunden.
   11. Waschen Sie die Embryonen, indem Sie die Embryonen aus der Hypochloritlösung in das Wachstumsmedium von Shelton übertragen, indem Sie mit der handgezogenen Kapillare für den Embryotransfer mundpipettieren (Abbildung 2B).
   12. Waschen Sie die Embryonen erneut, indem Sie die Embryonen in eine neue Vertiefung des Shelton-Wachstumsmediums übertragen, indem Sie mit der handgezogenen Kapillare für den Embryotransfer mundpipettieren (Abbildung 2B).
   13. Übertragen Sie die gewaschenen Embryonen in eine neue Vertiefung des Shelton-Wachstumsmediums, indem Sie mit der handgezogenen Kapillare für den Embryotransfer mundpipettieren. Verwenden Sie die handgezeichnete Kapillare zur Entfernung der Eierschale und wiederholen Sie das Pipettieren vorsichtig (Abbildung 2C; mittlere Schaltpläne). Gelingt es, die Eischale zu entfernen, werden die embryonalen Zellen kugelförmiger (Abbildung 2C; rechts).
   14. Trennen Sie die embryonalen Blastomere im 2-Zell-Stadium, indem Sie vorsichtig und kontinuierlich mit der handgezogenen Kapillare pipettieren, um die Eierschale zu entfernen (Abbildung 2D).

Abbildung 1: Blastomer-Isolierung.(A) Ziehen der Glaskapillare von Hand. (B) Handgezogene Glaskapillare für den Embryotransfer. (C) Handgezogene Glaskapillare zur Entfernung von Eierschalen. (D) Schemata mit der geeigneten Größe der Kapillaröffnung für die Entfernung der Eierschale. Pfeile zeigen Embryonen an. Die Maßstabsbalken zeigen 100 μm an.

Abbildung 2: Arbeitsablauf für die Blastomerisolation.(A) Dissektion von adulten C. elegans in Eisalzpuffer zur Gewinnung von Embryonen. Fotos zeigen Embryonen im 2-Zell- und 4-Zell-Stadium vor der Entfernung der Eierschale. (B) Behandlung und Waschen von Hypochlorit. (C) Die Schaltpläne zeigen den geeigneten Zeitpunkt für die Entfernung der Eierschalen. Das Foto zeigt einen Embryo im 4-Zell-Stadium nach der Entfernung der Eierschale. (D) Abtrennung von Blastomern. Das Foto zeigt einen abgetrennten Embryo im 2-Zell-Stadium. Die Größen der Pfeile in C und D geben die relativen Kräfte an, die beim Pipettieren erforderlich sind. Die Maßstabsbalken zeigen 50 μm an.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Aspirator-Rohr-Baugruppe	Drummond	21-180-13	Für die Blastomerisolierung.
Caenorhabditis elegans Stamm: N2, Wildtyp	Caenorhabditis Genetik Zentrum	N2	In dieser Studie verwendeter Stamm
Caenorhabditis elegans Stamm: KSG5, Genotyp: zuIs45; itIs37	im Haus	KSG5	In dieser Studie verwendeter Stamm
kalibrierte Mikropipetten, 10 μL	Drummond	Artikel-Nr.: 21-180-13	Für die Blastomer-Isolierung
CD Lipid Konzentrat	Lebenstechnologien	11905031	Für die Blastomer-Isolierung. Arbeiten in der Gewebekulturhaube.
Clorox	Clorox	N. A.	Für die Blastomer-Isolierung. Öffnen Sie eine neue Flasche, wenn die Hypochlorit-Behandlung nicht gut wirkt.
Deckglashalter	Im Haus	N.A.	Für die Blastomer-Isolierung.
Präpariermikroskop: Zeiss Stemi 508 mit M-Stativ. Die Lichtquelle ist die eingebaute LED. Die Vergrößerung des Okulars beträgt 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	Für die Blastomer-Isolierung.
Fötales Rinderserum, Qualified One Shot, Herkunft aus Kanada	Gibco	A3160701	Für die Blastomer-Isolierung. Arbeiten in der Gewebekulturhaube.
Injektionsnadeln für den allgemeinen Gebrauch und Präzisionsgleiten, 25 Gauge	Bd	Nr. 14-826AA	Für die Blastomer-Isolierung
Inulin	Alfa Aesar	AAA1842509	Für die Blastomer-Isolierung
MEM Vitaminlösung (100x)	Gibco	11120052	Für die Blastomer-Isolierung.
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedizin	ICN6041805	Für die Blastomer-Isolierung
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Gibco	15140148	Für die Blastomer-Isolierung.
Polyvinylpyrrolidon	Fisher BioReagenzien	Nr. BP431-100	Für die Blastomer-Isolierung
Kaliumchlorid	Bioladen	POC888	Für die Blastomer-Isolierung
Schneider's Drosophila Sterilmedium	Gibco	21720024	Für die Blastomer-Isolierung. Arbeiten in der Gewebekulturhaube.
Natriumchlorid	Bioladen	SOD001	Für die Blastomer-Isolierung
Natronlauge, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	Für die Blastomer-Isolierung
Spritzenvorsatzfilter, PTFE, unsteril	Basix	13100115	Für die Blastomer-Isolierung.
Tygon S3 Laborschlauch, Formulierung E-3603, Innendurchmesser 3.175 mm	Saint Gobain Performance Kunststoffe	Tel.: 89403-862	Für die Blastomer-Isolierung.
Tygon S3 Laborschlauch, Formulierung E-3603, Innendurchmesser 6,35 mm	Saint Gobain Performance Kunststoffe	Tel.: 89403-854	Für die Blastomer-Isolierung.