C. elegans Chemotaxis-Assay: Eine Methode zum Testen der Chemoempfindung bei Würmern

Zusammenfassung

Quelle: Campbell, J. C., et al. A Caenorhabditis elegans Nutritional-Status Based Copper Aversion Assay. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video stellt die Chemotaxis beim Fadenwurm C. elegans vor und zeigt ein Beispielprotokoll, das die chemotaktische Abneigung gegen Kupfersulfat testet.

Protokoll

Das folgende Protokoll ist ein Auszug aus Campbell et al., A Caenorhabditis elegans Nutritional-Status Based Copper Aversion Assay, J. Vis. Exp. (2017).

1. Präparation von Versuchsorganismen
   1. 10 Nematoden in L4-Stadien pro Stamm 24 Stunden vor Beginn des Tests auswählen, um sicherzustellen, dass die Organismen zum Zeitpunkt des Tests junge Erwachsene sind. Für jede getestete Mutante oder Kontrollnematode ist 10 L4 auszuwählen (10 für die Kontrolle und 10 für den Assay).
      1. Pflegen Sie L4-Organismen mit Standardmethoden für 24 Stunden auf Standard-Agarplatten, die mit OP50 Escherichia coli besiedelt sind. Wenn während der nachfolgenden Waschschritte Organismen verloren gehen, kompensieren Sie dies, indem Sie die Ausgangsstichprobengröße erhöhen (d. h. 20 statt 10 Würmer auswählen).
         HINWEIS: Verhalten ist ein von Natur aus variabler Phänotyp. Führen Sie die Methode in dreifacher Ausfertigung für jeden Stamm an drei verschiedenen Tagen durch. Fügen Sie zusätzliche Kontrollstämme und -bedingungen für neuartige Stämme hinzu, wie im Diskussionsabschnitt hervorgehoben.
   2. Unmittelbar vor dem Assay werden die experimentellen Organismen auf eine Agarplatte ohne Bakterien übertragen und die Nematoden 1 Minute lang frei bewegen können, um überschüssige Bakterien zu entfernen.
      1. Wenn Versuchsorganismen in den 24 Stunden vor dem Test Kontaminationsbedingungen aufwiesen, sind diese zu verwerfen.
   3. Pipettieren Sie 1 ml M9 auf die bakterienfreie Platte, um die Würmer in ein Mikrozentrifugenröhrchen zu spülen.
   4. Zentrifugieren Sie bei 3.000 x g für 1 min. Die Würmer sollten am Boden des Röhrchens ein Pellet bilden. Aspirieren Sie die M9-Lösung, ohne das Wurmkorn zu stören. Geben Sie 1 ml M9 zum Wurmpellet und drehen Sie das Röhrchen um, um die Würmer mit der Lösung zu mischen.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 1.4 noch dreimal.
      1. Wenn anfänglich überschüssige Bakterien mit den Würmern übertragen wurden, wiederholen Sie dies insgesamt 5 Mal. Es sollten keine Bakterien auf die kupfernen Lebensmittelplatten übertragen werden. Wenn Lebensmittel auf die Assay-Platte übertragen werden, beeinträchtigt dies die genaue Datenerfassung.
   6. Nach der letzten Wäsche wird der Überstand bis zu 100 μl M9 aspiriert, und das Wurmkorn bleibt zurück.
      Vorsicht: Hungerbedingte Verhaltensweisen werden nach 30 Minuten offensichtlich. Daher sollten Würmer sofort aus der Lösung übertragen werden, sobald die Waschschritte abgeschlossen sind.
2. Vorbereitung von Assay-Platten
   1. Bereiten Sie zwei Tage vor dem Assay Standard-NGM-Agarplatten vor.
      1. Wenn die Platten in einer feuchten Umgebung aufbewahrt werden, stellen Sie 3 Tage vor dem Assay Agarplatten her. Alternativ können Sie den Deckel der Platte für 3 - 6 Stunden abnehmen, um eine angemessene Trocknung zu gewährleisten (wenn Sie sich in einer sterilen Umgebung befinden).
   2. Ziehen Sie mit einem dicken Permanentmarker eine Linie auf der Unterseite der Platte entlang der Außenkante und eine weitere, um eine Mittellinienbarriere zu bilden (Abbildung 1). Die Mittellinienbarriere sollte von jeder Kante der Platte gleich weit entfernt sein. Verwenden Sie ein Lineal, um präzise Messungen zu gewährleisten. Diese Linien dienen als Leitfaden bei der Übertragung von Bakterien und der Kupferlösung. Unter der Voraussetzung, dass E. coli vor der Kupferlösung übertragen wird, dienen diese Linien als Indikatoren.
   3. Saatplatte mit 50 μL OP50 E. coli auf nur einer Seite der Kupferbarriere, um einen gleichmäßigen Rasen zu schaffen (Abbildung 2). Die Bakterienkonzentration sollte in allen Assays konstant bleiben. Es wurde jedoch eine geringe Variabilität als Reaktion auf leichte Konzentrationsunterschiede beobachtet.
      1. Verwenden Sie die markierten Linien auf der Unterseite der Platte, um sicherzustellen, dass die Bakterien nicht mit der Kupferlösung in Berührung kommen. Unter der Voraussetzung, dass die Kupferlösung den Rand der Platte auskleidet und eine Mittellinienbarriere bildet, übertragen Sie die Bakterien so, dass die Kupferlösung nicht mit der Nahrungsquelle in Berührung kommt.
   4. Markieren Sie einen zweiten Satz Platten und übertragen Sie keine OP50 E. coli auf diese (Abbildung 2). Diese Platten dienen zur Bewertung der Negativkontrolle. Diese Platten sollten auch auf einer Hälfte der Platte mit einer Markierung versehen sein, um den ursprünglichen Übertragungsursprung zu kennzeichnen.
   5. Lassen Sie die Bakterien trocknen und inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C. Stellen Sie sicher, dass die Bakterienflecken nicht gestört werden, wenn Sie in einen 37 °C heißen Inkubator oder Raum gebracht werden. Übermäßige Störungen können die Position oder Form des Futterpflasters verändern.
3. Chemotaxis-Analyse
   1. Bereiten Sie eine 0,5 M Kupfer(II)-sulfatlösung vor dem Assay-Start frisch vor. Unter der Voraussetzung, dass 125 μl der Lösung pro Platte verwendet werden, skalieren Sie dieses Volumen in Abhängigkeit von der Anzahl der verwendeten Assay-Platten (z. B. 5 Assay-Platten, 625 μl) hoch.
   2. Pipettieren Sie 100 μl der Kupfer(II)-sulfatlösung am Rand des Agars, um eine äußere Kupferbarriere zu schaffen. Die markierte Unterseite der Platte sollte als Orientierung dienen.
   3. Pipettieren Sie 25 μl der Kupfer(II)-sulfatlösung, um eine Mittellinienbarriere zu schaffen.
      1. Stellen Sie sicher, dass die Kupfer(II)-sulfatlösung nicht mit dem Bakterienpflaster in Berührung kommt. Verwenden Sie eine gefleckte Technik, da Schlieren die Fortbewegung aufgrund von Vertiefungen/Kratzern auf dem Agar beeinträchtigen können.
   4. Lassen Sie die Kupferlösung auf der Platte trocknen. Der Zeitraum kann je nach Platten- und Laborbedingungen variieren. Alle 5 Minuten nach der Übertragung visuell auf Trockenheit prüfen.
      HINWEIS: Die Kupferlösung weist einen bläulichen Farbton auf und ist leicht zu identifizieren. Tupfe die Lösung mit einem Labortuch leicht in der Nähe des Plattenrandes ab, um Trockenheit zu erkennen.
   5. Pipettieren Sie 20 μl des Wurmpellets vom Boden des Röhrchens auf die bakterienfreie Hälfte der Testplatte.
      1. Stellen Sie sicher, dass 10 Würmer auf die Assay-Platte übertragen werden. Wenn versehentlich zusätzliche Würmer hinzugefügt wurden, entfernen Sie sie, indem Sie sie mit Halogenkohlenwasserstofföl zupfen, um sicherzustellen, dass keine Bakterien auf die Platte gelangen. Jeder Assay sollte während des Assays eine konsistente Anzahl von Nematoden aufweisen.
         HINWEIS: Wenn während der Assays zu wenige Würmer übertragen werden, kann eine Erhöhung der anfänglichen Probengröße die potenziellen Verluste bei Waschungen und Transfers verringern.
   6. Entfernen Sie überschüssiges M9 mit einem Labortuch von der Platte. M9 darf nicht mit der Kupfer(II)-sulfatlösung in Berührung kommen.
      Achtung: Stellen Sie sicher, dass Würmer und die Agaroberfläche während dieses Schritts nicht beeinträchtigt werden. Bei zu starker Anwendung kann das Laborgewebe Vertiefungen auf der Agaroberfläche der Platte hinterlassen und Würmer entfernen. Würmer, die versehentlich über KimWipe entfernt wurden, sollten verworfen werden.
   7. Sobald die M9-Lösung entfernt wurde und alle Würmer begonnen haben, nicht-flüssige Bewegungsmuster zu entwickeln, starten Sie die Stoppuhr des Assays.
      1. Optimalerweise entfernen Sie die M9-Lösung innerhalb einer Minute. Der wesentliche Parameter ist die Identifizierung der sinusförmigen Fortbewegung. Würmer bewegen sich anders, z.B. schlagend statt sinusförmig, wenn sie sich in Flüssigkeit befinden. Starten Sie die Assay-Stoppuhr, sobald jeder der Versuchsorganismen aufhört zu schlagen.
   8. Überprüfen Sie die Assay-Platten alle 30 Minuten.
      1. Für die Assay-Platten mit Bakterienpflastern bewerten Sie die Organismen positiv, wenn sie das Lebensmittelpflaster über einen Zeitraum von 4 h erreichen. Für die negativen Kontrollplatten bewerten Sie Organismen positiv, wenn sie die Barriere überschritten haben.

Ergebnisse

Abbildung 1: Eine visuelle Darstellung von Markierungen zur Anzeige der Platzierung der Kupferlösung auf der Unterseite einer 5 cm großen Petrischale. Diese Angaben dienen dazu, sicherzustellen, dass die Abschnitte der Platte richtig vermessen wurden, und dienen als Richtwert beim Transfer des Bakterienpflasters und der anschließenden Kupferlösung auf die Agaroberfläche.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
M9 Lösung [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O auf 1 Liter. Autoklavieren zum Sterilisieren vor dem Gebrauch.]			Hergestellt im Labor
Kupfersulfat	Sigma	Nr. C-1297	Verwenden Sie Wasser, um es angemessen auf eine Konzentration von 0,5 M zu suspendieren