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Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Turek et al., Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).
>1. Calcium-Bildgebung
- Verwenden Sie transgene Stämme, die genetisch kodierte Kalziumsensoren exprimieren, wie z. B. HBR16 (goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119(+)]).
- Verwenden Sie ein Verbundmikroskop, das für die Weitfeld-Epifluoreszenz ausgerüstet ist. Verbinden Sie den TTL-Ausgang der EMCCD-Kamera mit dem TTL-Eingang der LED, so dass jedes Mal, wenn die Kamera ein Bild aufzeichnet, die Probe beleuchtet wird. Verwenden Sie eine Belichtungszeit von ca. 5 ms. Verwenden Sie eine EM-Verstärkung im Bereich von 50 - 300.
- Geben Sie einen Serienfilm an, der 24 Stunden lang läuft, wobei jeder Wurm alle 15 bis 30 Minuten zuerst 20 Sekunden lang mit DIC, dann 20 Sekunden lang mit einer GFP-Fluoreszenz abgebildet wird, um GCaMP aufzuzeichnen, und dann ein endgültiges Bild des mKate2-Signals aufnimmt, um die Expressionspegel zu kontrollieren. Verwenden Sie eine Bildrate von 2/s während jeder Burst.
- Verwenden Sie für die visuelle Dateninspektion eine Falschfarbenkarte, um die Sichtbarkeit kleiner Änderungen der Fluoreszenzintensität zu verbessern. Plotten Sie die Fluoreszenzdaten als ΔF/F, wobei F der durchschnittliche Ausgangswert der Fluoreszenz ist. Eine detaillierte Beschreibung der Calcium-Datenanalyse findet sich in der Literatur.