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Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Teoh et al., Quantitative Approaches for Study Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
>1. Quantifizierung der Muskelstruktur an der Körperwand
- Fluoreszenzbildgebung der Körperwandmuskelstruktur
- Erwerben Sie einen Stamm (z. B. RW1596), der das Transgen stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006))) trägt, das Myosinfasern mit GFP markiert.
HINWEIS: Die Einführung des Transgens in Tiere kann entweder durch Kreuzung eines interessierenden Stammes mit Tieren erreicht werden, die das Transgen bereits exprimieren, oder durch Mikroinjektion von DNA in den distalen Arm der Gonade. Der durch die rol-6-Mutation in diesem Transgen induzierte "rollende" Phänotyp erleichtert die Visualisierung der Muskeln. Die Körperwandmuskulatur verläuft entlang der Rücken- und Bauchseite, die bei Wildtypen normalerweise nicht sichtbar ist, da sie typischerweise auf einer ihrer Seitenseiten liegen. Das rol-6(su1006)-Allel induziert eine Verdrehung der Tiere, wodurch einige Muskelzellen für die Bildgebung freigelegt werden.
- Bilden Sie die Tiere mit einem Fluoreszenzmikroskop ab, das mit einer hochauflösenden CCD-Kamera (Charged Coupled Device Camera), einem 40-fachen Objektiv oder höher, einem GFP-Filter und einer Erfassungssoftware gekoppelt ist.
- Passen Sie die Belichtungszeit und die Beleuchtungsintensität an, um übersättigte Bilder zu vermeiden.
- Erfassen und Speichern von Bildern von Muskeln (400-fache Vergrößerung) aus einem Abschnitt des Tieres, der mindestens eine vollständige sichtbare schräge Muskelzelle enthält. Vermeiden Sie Regionen mit einer einzelnen Muskelzelle, die unvollständig ist, oder Abschnitte, die unscharf sind. Schließen Sie auch Bilder aus äußersten vorderen und hinteren Bereichen sowie von Regionen aus, die an die Vulva angrenzen.
HINWEIS: Wenn das Tier keine einzige sichtbare vollständige Muskelzelle hat, schieben Sie das Deckglas vorsichtig hinein, um das Tier so zu drehen, dass eine vollständige Zelle freigelegt wird.
- Messung der Muskelzellfläche
- Öffnen Sie das Image in der Fiji-Software (Version 2.0.0 wurde in dieser Studie verwendet).
- Verwenden Sie die Polygonauswahl, um vorsichtig um eine einzelne schräge Muskelzelle herum zu zeichnen. Passen Sie die Linie des Polygons am Ende an, indem Sie den Ankerpunkt ziehen, um die Nachzeichnung zu verbessern.
- Gehen Sie oben in der Software zur Registerkarte Analysieren und klicken Sie auf Messen, um den Bereich der Auswahl zu berechnen. Es wird eine separate Ergebnistabelle mit der Fläche und weiteren Messungen angezeigt. Wenn die Flächenmessung in der Ergebnistabelle fehlt, gehen Sie auf der Registerkarte Analysieren zu Messungen festlegen und überprüfen Sie, ob das Kontrollkästchen für die Fläche aktiviert ist. Deaktivieren Sie auch andere Messungen, die nicht benötigt werden.
- Bei Muskelzellen mit einer degenerierten/fehlenden Region verfolgen Sie die fehlende Region mit dem Polygonauswahlwerkzeug und klicken Sie erneut auf Messen. Wenn die Zelle mehrere Lücken aufweist, zeichnen Sie jede Lücke separat nach.
- Berechnen Sie das Verhältnis der Lückenfläche zur gesamten einzelnen Muskelzelle. Ein hohes Verhältnis deutet auf ein höheres Ausmaß der Muskeldegeneration aufgrund großer Lücken innerhalb der Zelle hin. Wenn keine Regionen fehlen, wie es bei Wildtyp-Tieren üblich ist, würde das Verhältnis als null berechnet.
HINWEIS: Als Kontrolle können Sie auch visuell für Muskelstrukturdefekte bewerten und die Ergebnisse mit der quantitativen Messung vergleichen. Dies ist besonders nützlich, wenn der Stamm zum ersten Mal im Labor untersucht wird. Für die phänotypische Bewertung beurteilen Sie die Tiere anhand der Integrität der Filamente als defekt oder nicht defekt. Zum Beispiel würden Tiere mit Verlust ausgeprägter Filamentstreifen, GFP-Verklumpung oder Lücken innerhalb von Muskelzellen aufgrund von strukturellem Abbau als defekt eingestuft.