Epidermale Laserverletzung: Induktion lokalisierter Schädigung zur Untersuchung von Reparaturprozessen bei C. elegans

Zusammenfassung

Quelle: Xu, S. und Chisholm, A. D. Methoden für Hautwunden und Assays für Wundreaktionen bei C. elegans.J. Vis. Exp.(2014).

Dieses Video stellt eine Methode der Laserverwundung vor, die verwendet wird, um sehr präzise Verletzungen in der Wurmepidermis zu verursachen. Das Beispielprotokoll stammt aus einer Studie über die Reaktion und Reparatur von Wunden.

Protokoll

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Xu und Chisholm, Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans, J. Vis. Exp. (2014).

>1. Laser-Verwundung

HINWEIS: Verwenden Sie Femtosekunden-Laserstrahlung (800 nm), um eine präzisere Verwundung durchzuführen.

1. Bereiten Sie Agar-Pads auf einem Objektträger mit geschmolzenem 2%igem Agar vor. Stellen Sie sicher, dass die Pads den Agar-Pads ähneln, die für die Live-Bildgebung von C. elegans verwendet werden.
2. Übertragen Sie 10 junge adulte Würmer mit einem Wurmpickel auf das Agarose-Pad und fügen Sie einen 2-μl-Tropfen 12 mM Levamisollösung hinzu. Decken Sie die Tiere und die Flüssigkeit mit einem Deckglas ab. Warten Sie 1-2 Minuten, bis die Würmer gelähmt sind.
3. Platzieren Sie den Objektträger auf einem konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop. Bewegen Sie den Tisch, um die Würmer zu finden, und konzentrieren Sie sich mit einem 100-fachen Objektiv (NA 1,4-1,46) auf die laterale vordere oder hintere synzytiale Epidermis.
4. Stellen Sie die Leistung des Femtosekundenlasers auf 140 mW ein (gemessen vor dem Objektiv). Verwenden Sie den Femtosekundenlaser mit einer Wiederholrate von 80 MHz.
   HINWEIS: Zwei Impulse von je 200 ms (getrennt durch 20 ms) genügen für die Verwundung in unseren Händen.
5. Fokussieren Sie sich auf die apikale Oberfläche der Epidermiszelle und wickeln Sie die Epidermis. Beobachten Sie eine lokale Störung des Zytoplasmas (Blasenbildung) oder ein lokales Bleichen eines verwendeten Fluoreszenzmarkers.
   HINWEIS: Befolgen Sie bei der Verwendung des Femtosekundenlasers die entsprechenden Lasersicherheitsverfahren. Linien- oder Punktscans mit Femtosekundenlasern, wie sie in zwei Photonenmikroskopen eingesetzt werden, sollten ausreichend Leistung für die Laserverwundung liefern.
   HINWEIS: Obwohl wir keine direkte Erfahrung mit der Verwendung anderer Laser haben, sollte eine Verwundung prinzipiell mit herkömmlichen UV-Lasern (wie sie bei C. elegans-Zellablatationen verwendet werden) möglich sein. Optional können Sie ein FRAP-Modul (Fluorescence Recovery After Photobleaching) auf einer konfokalen Spinning-Scheibe verwenden, um die Epidermis zu wickeln (N. Pujol, persönliche Mitteilung).