FITC-Dextran-Fütterung: Eine Methode zur Quantifizierung der Darmpermeabilität bei C. elegans

Zusammenfassung

Quelle: Le, T. A. N., et al. Messung der Auswirkungen von Bakterien und Chemikalien auf die Darmpermeabilität von Caenorhabditis elegans.J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video stellt eine Methode vor, mit der die Integrität des Darmlumens von C. elegans durch die Fütterung von Würmern mit FITC-markiertem Dextran visualisiert und gemessen werden kann. Das Beispielprotokoll zeigt den Assay, der mit 3,3'-Diindolylmethan (DIM)-behandelten und mit Krankheitserregern gefütterten Würmern durchgeführt wurde.

Protokoll

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Le et al., Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Herstellung von NGM-Platten zur Prüfung der Auswirkungen einer Chemikalie (DIM) auf die Darmpermeabilität von C. elegans, die mit P. aeruginosa gefüttert wurden
   1. Geben Sie 0,5 g Pepton, 0,6 g NaCl, 195 ml destilliertes Wasser, einen Magnetrührer und 6,8 g Agar in eine 500-ml-Glasflasche (NGM-Agar).
   2. Geben Sie 0,5 g Pepton, 0,6 g NaCl, 195 ml destilliertes Wasser und einen Magnetrührer ohne Agar in eine weitere 500-ml-Glasflasche (NGM-Brühe).
   3. Autoklavieren Sie die beiden Flaschen (aus den Schritten 1.1 bis 1.2), eine leere 100-ml-Glasflasche und eine leere 500-ml-Glasflasche für 15 Minuten bei 121 °C. Anschließend das Medium mit den Flaschen 30 min im Wasserbad auf 55 °C abkühlen lassen. Bewahren Sie das Agarmedium im Wasserbad auf und entfernen Sie die Flasche mit der Brühe (aus Schritt 1.2) für den nächsten Schritt.
   4. Fügen Sie der NGM-Brühe die Zusatzstoffe hinzu: 0,4 ml 1 M CaCl₂, 0,4 ml Cholesterin in Ethanol (ml), 0,4 ml 1 M MgSO₄ und 10 ml 1 M KPO₄ (alle diese Komponenten müssen mit Ausnahme des Cholesterins in Ethanol sterilisiert werden). Anschließend die Mischung mit einem Magnetrührer bei 55 °C gründlich umrühren.
   5. Beschriften Sie die autoklavierte leere 500-ml-Glasflasche mit Dimethylsulfoxid (DMSO) und die autoklavierte leere 100-ml-Glasflasche mit DIM.
   6. Füllen Sie 50 mL NGM-Bouillon in die mit DIM gekennzeichnete 100 mL-Flasche um. 500 μl 20 mM DIM-Brühe in die Flasche geben und gut vermischen.
      HINWEIS: DIM wird in DMSO aufgelöst (20 mM DIM-Lagerbestand).
   7. Nehmen Sie das NGM-Agarmedium schnell aus dem Wasserbad, geben Sie 50 mL des NGM-Agarmediums in die DIM-beschriftete Flasche und mischen Sie es gründlich.
   8. Geben Sie ein 20-ml-Aliquot DIM-haltiges NGM-Medium in jede 90 mm x 15 mm große Petrischale. In diesem Schritt können ca. fünf DIM-haltige NGM-Platten hergestellt werden.
      HINWEIS: Die endgültige Konzentration von DIM in jeder NGM-Platte beträgt 100 μM.
   9. Um die DMSO-haltige NGM-Platte vorzubereiten, geben Sie 150 mL NGM-Bouillon in die DMSO-markierte 500 mL-Flasche. Geben Sie 1,5 mL DMSO in die Flasche und mischen Sie gut.
   10. Geben Sie 150 mL des NGM-Agar-Mediums in die DMSO-markierte Flasche und mischen Sie es gründlich.
   11. Geben Sie ein 20-ml-Aliquot DMSO-haltiges NGM-Medium in jede 90 mm x 15 mm große Petrischale. In diesem Schritt können ca. fünfzehn DMSO-haltige NGM-Platten hergestellt werden.
       HINWEIS: Die Endkonzentration von DMSO in jeder NGM-Platte beträgt 0,5%.
   12. Die Platten mindestens 3 h bei Raumtemperatur fest werden lassen und bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
       HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
   13. Nehmen Sie die E. coli OP50- oder P. aeruginosa PAO1-Kultur aus dem 4 °C-Kühlschrank und wirbeln Sie die Kultur ordnungsgemäß ein, bevor Sie sie auf die NGM-Platten verteilen.
   14. Geben Sie 800 μl der Bakterienkultur E. coli OP50 oder P. aeruginosa PAO1 auf jede frische NGM-Agarplatte und lassen Sie die Platten über Nacht in einem 20 °C heißen Inkubator trocknen.
       HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Für das dritte Experiment (Abbildung 1) wurden zwei DMSO-haltige NGM-Platten, die mit lebendem E. coli OP50 beschichtet waren, eine DMSO-haltige NGM-Platte, die mit lebendem P. aeruginosa PAO1 beschichtet war, und eine DIM-haltige NGM-Platte, die mit lebendem P. aeruginosa PAO1 beschichtet war, hergestellt.
2. Behandlung von Bakterien oder DIM und FITC-Dextran Fütterung
   1. Inkubieren Sie die alterssynchronisierten Eier bei 20 °C für 64 h auf NGM-Platten, die mit lebenden E. coli OP50 als Futter ergänzt werden.
   2. Waschen Sie die alterssynchronisierte L4-Larve mit S-Puffer und übertragen Sie sie (mehr als ca. 500 Würmer) auf die Behandlungs-NGM-Platten, die verschiedene Bakterien und Chemikalien enthalten. Inkubieren Sie sie bei 20 °C für 48 h.
      HINWEIS: Die Behandlungszeit kann je nach den verwendeten Bakterien und Chemikalien zwischen 24 und 72 Stunden liegen. Die therapeutische oder vorbeugende Wirkung von DIM kann auch bewertet werden, indem die Würmer mit Krankheitserregern vorbehandelt und dann die Würmer mit DIM behandelt werden (die therapeutische Wirkung) oder indem die Würmer mit DIM vorbehandelt und dann mit Krankheitserregern behandelt werden (die vorbeugende Wirkung).
   3. Zur Herstellung der mit FITC-Dextran ergänzten Platten mischen Sie 2 ml hitzeinaktivierte E. coli OP50 mit 4 mg FITC-Dextran. Dann 100 μl des Gemisches aus FITC-Dextran und E. coli OP50 in zwanzig frische NGM-Agarplatten (60 mm x 15 mm) aufteilen und die Platten 1 h auf einer sauberen Bank trocknen lassen.
      HINWEIS: Die Endkonzentration von FITC-Dextran in jeder NGM-Platte beträgt 20 μg/ml.
   4. Bereiten Sie fünf E. coli OP50-haltige NGM-Platten ohne FITC-Dextran für die Vehikelkontrollbehandlung vor. Zu diesem Zweck werden je 100 μL hitzeinaktivierte E. coli OP50 auf jede frische NGM-Agarplatte (60 mm x 15 mm) aufgeteilt und die Platten 1 h auf einer sauberen Bank trocknen lassen.
      HINWEIS: Für jedes unabhängige Experiment werden fünfzehn mit FITC-Dextran ergänzte NGM-Platten und fünf NGM-Platten ohne FITC-Dextran benötigt.
   5. Nach 48 h Behandlung (ab Schritt 2.2) waschen Sie die Würmer mit S-Puffer, überführen Sie die Würmer auf die mit FITC-Dextran ergänzten Platten und die NGM-Platten ohne FITC-Dextran und inkubieren Sie die Platten über Nacht (14–15 h).
      HINWEIS: Für jede Behandlungsgruppe sind 5 Wiederholungen der FITC-Dextran-Färbung (oder Vehikelkontrollfütterung) erforderlich.
   6. Waschen Sie die Würmer mit S-Puffer und lassen Sie sie 1 h.
      in der frischen NGM-Agarplatte kriechen HINWEIS: Für jedes unabhängige Experiment werden insgesamt 20 frische NGM-Platten benötigt. In diesem Schritt können Sie die NGM-Platte verwenden, die ohne oder mit E. coli OP50 ergänzt wurde.
   7. Geben Sie 50 μl 4%ige Formaldehydlösung in jede Vertiefung einer schwarzen 96-Well-Platte mit flachem Boden. Übertragen Sie ca. 50 Würmer aus jeder NGM-Platte in jede Vertiefung für Fluoreszenzmessungen. Entfernen Sie nach 1 bis 2 Minuten gründlich das gesamte Formaldehyd aus jeder Vertiefung und fügen Sie 100 μl Einbettmedium hinzu, um die Vertiefungen zu beschichten.
      HINWEIS: Formaldehydlösung (4%) wird verwendet, um die Würmer ruhigzustellen und zu fixieren. Für jede Behandlungsgruppe werden 5 Wells (5 Replikate) für die Bildanalyse verwendet.
3. Bildgebung von C. elegans mit dem Operetta Imaging System und Bestimmung der Darmpermeabilität durch Messung der FITC-Dextran-Fluoreszenzaufnahme
   HINWEIS:Für die Bildanalyse kann die Fluoreszenz-Stereomikroskopie anstelle des Operetta-Systems verwendet werden.
   1. Nehmen Sie Fluoreszenzbilder auf und messen Sie die Fluoreszenzintensität mit dem Operetta High-Content Imaging System und analysieren Sie die Bilder mit der Harmony-Software.
   2. Drücken Sie in der Harmony-Software auf das Symbol Deckel öffnen, um den Deckel zu öffnen und die Platte in die Maschine einzusetzen.
   3. Richten Sie die Parameter ein.
   4. Klicken Sie auf Einrichten, wählen Sie den Plattentyp aus (96-Well-Corning mit flachem Boden) und fügen Sie die Kanäle (Hellfeld- und EGFP-Kanäle) hinzu.
   5. Passen Sie das Layout an. Gehen Sie zur Auswahl Layout, wählen Sie Spur und passen Sie die Parameter an (erstes Bild bei 1 μm, Anzahl der Ebenen sind 10, Abstand ist 1 μm).
   6. Wählen Sie eine der Behandlungsvertiefungen und ein Erfassungsfeld aus, und drücken Sie auf Test, um im Abschnitt Experiment ausführen zu überprüfen, ob die Bilder zufriedenstellend sind.
   7. Wenn die Bilder zufriedenstellend sind, kehren Sie zum Abschnitt Einrichten zurück und drücken Sie auf das Zurücksetzen-Symbol am Ende des Bildschirms. Wählen Sie dann alle Ziel-Wells und eine geeignete Anzahl von Erfassungsfeldern aus.
   8. Wechseln Sie erneut zu Experiment ausführen, geben Sie den Plattennamen ein und drücken Sie dann Start, um mit der Verarbeitung zu beginnen.
   9. Um die Intensität der Fluoreszenz zu messen, gehen Sie zum Abschnitt Bildanalyse und geben Sie das Bild ein. Suchen Sie die Zelle, indem Sie den EGFP-Kanal und die Methode B auswählen. Stellen Sie den gemeinsamen Schwellenwert auf 0,5, die Fläche auf >200 μm², den Split-Faktor auf 3,0, den individuellen Schwellenwert auf 0,18 und den Kontrast auf mehr als 0,18 ein. Berechnen Sie dann die Intensitätseigenschaften und wählen Sie den Mittelwert als Ausgabe aus. Klicken Sie auf das Symbol Übernehmen, um das Setup zu speichern.
   10. Gehen Sie zum Abschnitt Auswertung, um die Intensität zu messen, indem Sie eine Heatmap und eine Datentabelle abrufen. Stellen Sie den Parameter Auslesung auf Zellen — Intensität Zelle EGFP Mittelwert — Mittelwert pro Vertiefung und starten Sie die Auswertung.
       HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
   11. Um die Daten aus Operetta zu extrahieren, klicken Sie auf die Schaltfläche Einstellung und wählen Sie Datenverwaltung.
   12. Wählen Sie Write archive (Archiv schreiben) aus, öffnen Sie dann das Durchsuchen, und wählen Sie die Datei aus.
   13. Um die Datei auszuwählen, klicken Sie auf das kleine +-Signal in der linken Ecke, klicken Sie dann auf Messung und wählen Sie Plattenname aus.
   14. Wählen Sie die Datei aus und klicken Sie auf OK.
   15. Wählen Sie den Pfad zum Speichern der Datei aus, indem Sie auf das Durchsuchen-Signal am aktiven Pfad klicken.
   16. Klicken Sie auf Start, um die Datendatei zu speichern.
       HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
4. Statistische Analyse der FITC-Dextran-Fluoreszenz von C. elegans
   1. Importieren Sie die Daten und berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung (SD) mit einer Statistiksoftware.
   2. Analysieren Sie den signifikanten Unterschied mit einer unidirektionalen Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest.

Ergebnisse

Abbildung 1: Die Wirkung von DIM auf die intestinale Permeabilität von C. elegans, die mit P. aeruginosa gefüttert werden.Mikroskopische Aufnahmen von Würmern aus (A) E. coli OP50 ohne FITC-Dextran-Fütterung, (B) E. coli mit FITC-Dextran-Fütterung, (C

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3,3'-Diindolylmethan	Sigma	D9568
90×15 mm Petrischalen	SPL Life Sciences, Südkorea	Nr. 10090
Bactor-Agar	Beckton Dickinson	NR. 214010
Formaldehyd-Lösung	Sigma	Nr. F1635
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetikzentrum (CGC)		Wildtyp
Cholesterin	Sigma	Nr. C3045
Costa Assay Platte, 96 Well schwarz mit klarem flachem Boden, unbehandelt, ohne Deckel Polystyrol	Corning Incorporated	NR. 3631
Dimethylsulfoxid	Sigma	Nr. D2650
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetikzentrum (CGC)
Fluorescein-Isothiocyanat - Dextran	Sigma	FD10S
Harmony-Software	PerkinElmer		Versi 3.5
Magnesiumsulfat-Heptahydrat	Fisher Bioreagenzien	Artikel-Nr.: BP2213-1
Fluormount wässriges Eindeckmedium	Sigma	Nr. F4680
Operetta CLS High-Content-Analysesystem	PerkinElmer	HH16000000
Pepton	Merck	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	Koreanische Sammlung für Schriftkultur	KCTC NR. 1637
Natriumchlorid	Fisher Bioreagenzien	Nr. BP358-1
Stereomikroskop	Nikon, Japan	SMZ800N