FITC-Dektran Besleme: C. eleganlarda Bağırsak Geçirgenliğini Ölçme Yöntemi

Overview

Bu video, FITC etiketli dektran solucanlarını besleyerek C. elegans bağırsak lümeninin bütünlüğünü görselleştirmek ve ölçmek için bir yöntem sunar.  Örnek protokol, 3,3'-diindolylmethane (DIM) ile yapılan test ve patojenle beslenen solucanları gösterir.

Protocol

Bu protokol, Bakteri ve Kimyasalların Caenorhabditis elegans,J. Vis. Exp Bağırsak Geçirgenliği Üzerindeki Etkilerini Ölçen Le ve ark.'danbir alıntıdır. (2019).

1. P. aeruginosa ile Beslenen C. eleganların Bağırsak Geçirgenliği Üzerindeki Bir Kimyasalın (DIM) Etkilerini Test Etmek için NGM Plakalarının Hazırlanması
   1. 500 mL cam şişeye (NGM agar) 0,5 g pepton, 0,6 g NaCl, 195 mL damıtılmış su, manyetik karıştırıcı ve 6,8 g agar ekleyin.
   2. Başka bir 500 mL cam şişeye (NGM suyu) 0,5 g pepton, 0,6 g NaCl, 195 mL damıtılmış su ve agarsız manyetik karıştırıcı ekleyin.
   3. İki şişeyi (1.1–1.2 adımlarından itibaren), bir boş 100 mL cam şişeyi ve bir boş 500 mL cam şişeyi 121 °C'de 15 dakika boyunca otoklavlayın. Daha sonra, şişe içeren ortamın su banyosunda 30 dakika boyunca 55 °C'ye kadar soğumasını bekleyin. Agar ortamını su banyosunda tutun ve bir sonraki adım için et suyu içeren şişeyi (adım 1.2'den) çıkarın.
   4. Katkı kimyasallarını NGM suyuna ekleyin: 0.4 mL 1 M CaCl_2,etanolde (mL) 0.4 mL kolesterol, 1 M MgSO_{4'ün 0.4} mL'si ve 1 M KPO_{4'ün 10} mL'si (bu bileşenlerin tümü etanoldeki kolesterol dışında sterilize edilmelidir). Ardından, karışımı 55 ° C'de manyetik bir karıştırıcı ile iyice karıştırın.
   5. Otomatik kapatılmış boş 500 mL cam şişeyi dimetil sülfit (DMSO) ve otoklavlanmış boş 100 mL cam şişeyi DIM ile etiketle.
   6. DIM etiketli 100 mL şişeye 50 mL NGM suyu aktarın. Şişeye 500 μL 20 mM DIM stoğu ekleyin ve iyice karıştırın.
      NOT: DIM, DMSO'da (20 mM DIM stoğu) çözülür.
   7. NGM agar ortamını su banyosundan hızla çıkarın, DIM etiketli şişeye 50 mL NGM agar ortamı ekleyin ve iyice karıştırın.
   8. Her 90 mm x 15 mm Petri kabına 20 mL'lik bir DIM içeren NGM ortamı yerleştirin. Bu adımdan yaklaşık beş DIM içeren NGM plakası yapılabilir.
      NOT: Her NGM plakasında son DIM konsantrasyonu 100 μM olacaktır.
   9. DMSO içeren NGM plakasını hazırlamak için 150 mL NGM suyunu DMSO etiketli 500 mL şişeye aktarın. Şişeye 1,5 mL DMSO ekleyin ve iyice karıştırın.
   10. DMSO etiketli şişeye 150 mL NGM agar ortamı ekleyin ve iyice karıştırın.
   11. Her 90 mm x 15 mm Petri kabına 20 mL DMSO içeren NGM ortamı yerleştirin. Bu adımdan yaklaşık on beş DMSO içeren NGM plakası yapılabilir.
       NOT: Her NGM plakasında DMSO'nun son konsantrasyonu% 0,5 olacaktır.
   12. Plakaları oda sıcaklığında en az 3 saat katılaştırın ve kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
       NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
   13. E. coli OP50 veya P. aeruginosa PAO1 kültürünü 4 °C buzdolabından çıkarın ve NGM plakalarına yayılmadan önce kültürü düzgün bir şekilde girdaplayın.
   14. Her taze NGM agar plakasına 800 μL E. coli OP50 veya P. aeruginosa PAO1 bakteri kültürünü koyun ve plakaların bir gecede 20 °C inkübatörde kurumasını bekleyin.
       NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Üçüncü deney için (Şekil 1), canlı E. coli OP50 ile kaplanmış iki DMSO içeren NGM plakası, canlı P. aeruginosa PAO1 ile kaplanmış bir DMSO içeren NGM plakası ve canlı P. aeruginosa PAO1 ile kaplanmış bir DIM içeren NGM plakası hazırlandı.
2. Bakteri veya DIM ve FITC-dektran Beslemesinin Tedavisi
   1. Yaş senkronize yumurtaları 20 °C'de 64 saat boyunca canlı E. coli OP50 ile desteklenmiş NGM plakalarında kuluçkaya yatırın.
   2. Yaş senkronize L4 larvalarını S-tampon ile yıkayın ve farklı bakteri ve kimyasallar içeren tedavi NGM plakalarına aktarın (yaklaşık 500 solucandan fazla). 20 °C'de 48 saat kuluçkaya yatırın.
      NOT: Kullanılan bakteri ve kimyasallara göre tedavi süresi 24 ila 72 saat arasında değişebilir. DIM'in terapötik veya önleyici etkisi, solucanları patojenlerle önceden tedavi ederek ve daha sonra solucanları DIM (terapötik etki) ile tedavi ederek veya solucanları DIM ile önceden tedavi ederek ve daha sonra patojenlerle (önleyici etki) tedavi ederek de değerlendirilebilir.
   3. FITC-dekstran takviyeli plakaları hazırlamak için, 2 mL ısı inaktive E. coli OP50'yi 4 mg FITC-dektran ile karıştırın. Ardından, FITC-dextran ve E. coli OP50 karışımının 100 μL'lik kısmını yirmi taze NGM agar plakasına (60 mm x 15 mm) bölün ve plakaların temiz bir tezgahta 1 saat kurumasını bekleyin.
      NOT: Her NGM plakasında FITC-dektranın son konsantrasyonu 20 μg/mL olacaktır.
   4. Araç kontrol tedavisi için FITC-dextran içermeyen beş E. coli OP50 içeren NGM plakası hazırlayın. Bu amaçla, 100 μL ısı inaktive E. coli OP50'yi her taze NGM agar plakasına (60 mm x 15 mm) bölün ve plakaların temiz bir tezgahta 1 saat kurumasını bekleyin.
      NOT: Her bağımsız deney için on beş FITC-dektran takviyeli NGM plakası ve FITC-dekstran içermeyen beş NGM plakası gereklidir.
   5. 48 saatlik tedaviden sonra (adım 2.2'den itibaren), solucanları S-tamponu ile yıkayın, solucanları FITC-dextran takviyeli plakalara ve FITC-dektran içermeyen NGM plakalarına aktarın ve plakaları bir gecede kuluçkaya yatırın (14-15 saat).
      NOT: Her tedavi grubu için 5 adet FITC-dektran boyama (veya araç kontrol beslemesi) gereklidir.
   6. Solucanları S tamponu ile yıkayın ve taze NGM agar plakasında 1 saat boyunca sürünmelerine izin verin.
      NOT: Her bağımsız deney için toplam 20 taze NGM plakasına ihtiyaç vardır. Bu adımda, E. coli OP50 olmadan veya E. coli OP50 ile desteklenmiş NGM plakasını kullanabilirsiniz.
   7. Siyah 96 kuyulu düz tabanlı plakanın her kuyusuna 50 μL% 4 formaldehit çözeltisi ekleyin. Floresan ölçümleri için her NGM plakasından her kuyuya yaklaşık 50 solucan aktarın. 1 ila 2 dakika sonra, her kuyudaki tüm formaldehitleri iyice çıkarın ve kuyuları kaplamak için 100 μL montaj ortamı ekleyin.
      NOT: Formaldehit çözeltisi (%4) solucanları hareketsiz hale getirmek ve düzeltmek için kullanılır. Her tedavi grubu için görüntü analizi için 5 kuyu (5 çoğaltma) kullanılır.
3. FITC-dekstran Floresan Alımını Ölçerek Operet Görüntüleme Sistemi ile C. eleganların Görüntülenmesi ve Bağırsak Geçirgenliğinin Belirlenmesi
   NOT: Operetta sistemi yerine görüntü analizi için floresan stereomikroskop kullanılabilir.
   1. Operetta Yüksek İçerikli Görüntüleme Sistemi'ni kullanarak floresan görüntülerini yakalayın ve floresan yoğunluğunu ölçün ve görüntüleri Harmony yazılımı ile analiz edin.
   2. Harmony yazılımında, kapağı açmak ve plakayı makineye koymak için kapağı aç simgesine basın.
   3. Parametreleri ayarlayın.
   4. Ayarla 'yıtıklatın, plaka tipini seçin (96 kuyulu corning düz-alt) ve kanalları (parlak alan ve EGFP kanalları) ekleyin.
   5. Düzeni ayarlayın. Mizanpaj seçiminegidin ve parametreleri İzle ve ayarla 'yı seçin (ilk resim 1 μm'de, düzlem sayısı 10, mesafe 1 μm'dir).
   6. Tedavi kuyularından birini ve bir yakalama alanını seçin ve Denemeyi çalıştır bölümünde resimlerin tatmin edici olup olmadığını kontrol etmek için Test'e basın.
   7. Resimler tatmin ediciyse, Kurulum bölümüne dönün ve ekranın sonundaki Sıfırla simgesine basın. Ardından, tüm hedef kuyuları ve uygun sayıda yakalama alanını seçin.
   8. Denemeyi yeniden çalıştır'a gidin ve plaka adını girin, sonra işlemeye başlamak için Başlat'a basın.
   9. Floresanın yoğunluğunu ölçmek için görüntü analizi bölümüne gidin ve görüntüyü girin. EGFP kanalını ve yöntemi B'yi seçerek hücreyi bulun. Ardından, yoğunluk özelliklerini hesaplayın ve çıktı olarak ortalamayı seçin. Kurulumu kaydetmek için Uygula simgesine basın.
   10. Bir ısı haritası ve veri tablosu elde ederek yoğunluğu ölçmek için Değerlendirme bölümüne gidin. Okuma parametresini Hücreler — Yoğunluk Hücresi EGFP Ortalaması — Kuyu Başına Ortalama olarak ayarlayın ve değerlendirmeyi başlatın.
       NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
   11. Verileri Operetta'dan ayıklamak için Ayar düğmesini tıklatın ve Veri yönetimi'ni seçin.
   12. Arşivi yaz'ı seçin ve gözatmayı açın ve dosyayı seçin.
   13. Dosyayı seçmek için, sol köşedeki küçük + sinyalini tıklatın ve sonra Ölçü 'nün üzerine tıklayın ve Plaka adı 'nıseçin.
   14. Dosyayı seçin ve Tamam'ı tıklatın.
   15. Etkin yoldaki Gözat sinyalini tıklatarak dosyayı kaydedecek yolu seçin.
   16. Veri dosyasını kaydetmek için Başlat'ı tıklatın.
       NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
4. C. elegans FITC-dekstran Floresan İstatistiksel Analizi
   1. Verileri içe aktarın ve bir istatistik yazılımı kullanarak ortalama ve standart sapmayı (SD) hesaplayın.
   2. Tukey'in çoklu karşılaştırma testinin ardından tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile önemli farkı analiz edin.

Representative Results

Şekil 1: DIM'in C. elegans'ın bağırsak geçirgenliği üzerindeki etkisi P. aeruginosa ile beslendi.  FITC-dekstran beslemesi olmayan(A) E. coli OP50, (B) FITC-dekstran beslemeli E. coli, (C) FITC-dekstran beslemeli P. aeruginosa PAO1 ve (D) P. aeruginosa ve DIM (100 μM) kotreatmentinden fitc-dekstran beslemeli solucanların mikroskopi görüntüleri. Ölçek çubuğu = 1 mm (beyaz) ve 200 μm (siyah). Yaş senkronize L4 larvaları, canlı E. coli (A, B), canlı P. aeruginosa (C), canlı P. aeruginosa ve DIM (D) ile tohumlanan NGM plakalarında 48 saat boyunca inkübe edildi. Daha sonra solucanlar, araç kontrolü (A) dışında FITC-dektran (B-D) içeren plakalara aktarıldı. (E) FITC floresan yoğunluğu, C. eleganların bağırsak geçirgenliğinin DIM'den etkilendiğini gösterir. Sütunlar ve hata çubukları, araç kontrolünden önemli bir fark için ortalama ± SD.**P < 0.001'i gösterir. ^###P < 0.001 ve ^##P < 0.01 P. aeruginosa PAO1 ile beslenen FITC-dextran ile tedavi edilen solucanlardan önemli fark için (ANOVA, n = 5). Bu grafik iki bağımsız deneyi temsil eder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3’-diindolylmethane	Sigma	D9568
90×15 mm Petri dishes	SPL Life Sciences, South Korea	10090
Bactor Agar	Beckton Dickinson	REF. 214010
Formaldehyde solution	Sigma	F1635
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Wild type
Cholesterol	Sigma	C3045
Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene	Corning Incorporated	REF. 3631
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescein isothiocyanate - dextran	Sigma	FD10S
Harmony software	PerkinElmer		verson 3.5
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Bioreagents	BP2213-1
Fluoromount aqueous mounting medium	Sigma	F4680
Operetta CLS High-Content Analysis System	PerkinElmer	HH16000000
Peptone	Merck	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	Korean Collection for Type Culture	KCTC NO. 1637
Sodium Chloride	Fisher Bioreagents	BP358-1
Stereo Microscope	Nikon, Japan	SMZ800N