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Das folgende Protokoll ist ein Auszug aus Farboud et al., Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms, J. Vis. exp.(2018).
>1. RNP-Montage
- Planen Sie das Experiment weit im Voraus und erwerben Sie alle RNA-, DNA- und Proteinkomponenten im Voraus. Versuchen Sie als ersten Durchgang eine der in Tabelle 1 aufgeführten Positivkontrollen und verwenden Sie die in der Materialtabelle beschriebenen kommerziellen Reagenzien, um ein zuverlässiges Versuchsdesign und die Integrität der Materialien zu gewährleisten. Weitere Tipps zur Planung eines neuen Genom-Editing-Experiments finden Sie in den Artikeln zu diesem Thema.
HINWEIS: Einmal zusammengebaut, wie in den nachfolgenden Schritten beschrieben, können im Voraus vorbereitete RNPs bei -80 °C gelagert werden.
- Nachdem Sie sich für ein Gen entschieden haben, verwenden Sie eines der kostenlosen Online-Tools, um eine optimale gRNA zu entwerfen. Achten Sie darauf, ein Exon anzuvisieren, wenn Sie hoffen, einen Knockout zu generieren.
HINWEIS: Diese Tools helfen bei der Identifizierung einer Zielstelle mit einer angrenzenden S. pyogenes PAM-Sequenz, einem hohen Qualitätswert und einem niedrigen Off-Target-Score.
- Reinigen Sie das S. pyogenes Cas9-Protein durch veröffentlichte Methoden oder kaufen Sie es von einem kommerziellen Anbieter.
- Bereiten Sie einen typischen Cas9-Puffer für die RNA-Verdünnung, die RNP-Vorbereitung und die Proteinlagerung vor, der 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 10 % Glycerin und 1 mM TCEP enthält. Verwenden Sie immer nukleasefreies Wasser in Puffern, die zur Resuspendierung oder Verdünnung der RNA verwendet werden, um einen Abbau zu verhindern.
- Stellen Sie die Guide-RNA (tracrRNA und crRNA oder sgRNA) durch eine In-vitro-Transkription mit veröffentlichten Methoden her oder erwerben Sie sie von einem Unternehmen für Nukleinsäuresynthese.
- Wenn Sie ein Gen einfügen, synthetisieren oder kaufen Sie eine Spender-DNA-Vorlage.
- Lagern Sie die Protein- und RNA-Aliquoten bei -80 °C und tauen Sie sie unmittelbar vor der Verwendung auf Eis auf.
HINWEIS: Jedes Einfrieren-Auftauen senkt den Wirkungsgrad leicht. Detaillierte, frei zugängliche Protokolle für die Cas9-Aufreinigung und die In-vitro-Transkription von sgRNAs sind an anderer Stelle verfügbar.
- RNP-Vorbereitung für die Bearbeitung von C. elegans: Assemblieren Sie den RNP-Komplex durch Zugabe der folgenden Reagenzien, um ein Endvolumen von 20 μl zu erzeugen (die endgültigen Konzentrationen sind in Klammern angegeben): Cas9 (2 μM), HEPES pH 7,5 (10 μM), KCl (115 μM), crRNA (12 μM), tracrRNA (40 μM), und bei Bedarf die Reparaturschablonen (0,5 μM ssDNA oder bis zu 350 ng/μL dsDNA).
HINWEIS: Die Effizienz einer Cas9-vermittelten DSB-Template-Reparatur ist proportional zur Konzentration des dsDNA-Reparaturkonstrukts; Je höher also die Konzentration der Reparaturschablone ist, desto effizienter ist die Reparaturschablone. Es hat sich jedoch gezeigt, dass eine Injektion von Mischungen, die mehr als 350 ng/μl dsDNA enthalten, die Lebensfähigkeit der injizierten Würmer verringert. Daher ist es am besten, bis zu 350 ng/μl dsDNA in der Mischung zu verwenden, um die Reparatureffizienz zu maximieren und gleichzeitig die Letalität zu minimieren.
- Fügen Sie mehrere crRNAs hinzu, um mehrere Loci gleichzeitig anzugreifen, wie für den Co-CRISPR/Co-Conversion-Screening-Ansatz erforderlich. Wenn Sie mehr als eine crRNA hinzufügen, fügen Sie jede crRNA nacheinander zum Mastermix hinzu.
HINWEIS: Die Menge jeder crRNA muss nicht gleich sein, und selbst eine Verdoppelung der Gesamtkonzentration von crRNAs im Mastermix ohne Änderung der Konzentration von Cas9 scheint die Häufigkeit der Mutagenese an einem bestimmten Ort nicht zu beeinträchtigen. Beispiele sind in Paix et al. ausführlich beschrieben.
- Mischen Sie durch Pipettieren und schleudern Sie die RNP-Lösung 5 s lang bei 16.000 x g, um sicherzustellen, dass die Lösung am Boden des Röhrchens gesammelt wird.
- Die Lösung bei 37 °C 15 m lang inkubieren.
- Zentrifugieren Sie die Probe 1 Minute lang bei 16.000 x g, um Partikel zu pelletieren, die die Mikroinjektionsnadel mit dünner Bohrung verstopfen könnten. Verwenden Sie den Überstand in den folgenden Schritten.
- C. elegans Zubereitung
1. 1. 1 Tag vor der Mikroinjektion: Bereiten Sie die Agarose-Pads für die Mikroinjektion vor.
- Stellen Sie eine 3%ige (w/v) Agaroselösung in Wasser her, indem Sie Agarose in Wasser geben und die Lösung auf einer heißen Platte oder in der Mikrowelle zum Kochen bringen.
- Ordnen Sie 24 mm x 50 mm x 1,5 mm große Objektträger auf einem Tisch an und geben Sie mit einer Pasteur-Glaspipette einen kleinen Tropfen (~15 μl) Agaroselösung auf den Objektträger. Den Agarosetropfen schnell flach drücken, indem du ein weiteres Deckglas darauf legst. Lassen Sie die Agarose fest werden und entfernen Sie dann eines der Deckgläser.
- Lassen Sie das mit Agarose überzogene Deckglas mit der Vorderseite nach oben über Nacht auf einer Tischplatte trocknen. Nach 24 h die Agarose-Pads in einem sauberen, trockenen Behälter aufbewahren.
HINWEIS: Diese können unbegrenzt verwendet werden.
2. Ziehen Sie die Mikroinjektionsnadeln: Verwenden Sie Borosilikatglaskapillaren mit Filamenten (Außendurchmesser 1,0 mm und Innendurchmesser 0,58 mm), ziehen Sie die Nadeln basierend auf Mello und Fire57 und anderen Ressourcen. Die Nadeln können sofort verwendet oder in einem sauberen, trockenen Behälter aufbewahrt werden, der durch Tonstützen versteift ist.
3. Für die Pflege der Würmer bereiten Sie einen Nematoden-Wachstumsmedium (NGM) Agar vor, der in Petriplatten gegossen und mit OP50-Bakterien befleckt wird (für Protokolle zur Standardpflege von C. elegans und Rezepte für Wachstumsmedien siehe Stiernagle).
4. Bereiten Sie die Würmer für die Mikroinjektion bereit: 12-24 h vor der Mikroinjektion, nehmen Sie L4-inszenierte Hermaphroditen auf eine neue NG-Agar-Platte mit OP50-Bakterien und inkubieren Sie sie über Nacht bei 20 °C. Für jede Cas9-Ziel-/Injektionsmischung pflücken Sie ~30 Würmer auf die Platte.
- Tag der Mikroinjektion: Laden Sie die gezogene Mikroinjektionsnadel mit dem in Schritt 1.2 vorbereiteten RNP-Lösungsüberstand.
- Der Überstand aus Schritt 1.2.4 wird in eine gezogene Kapillarpipette pipettiert und die Lösung aus der Kapillarpipette in die vorbereitete Mikroinjektionsnadel verfüllt (in der Regel weniger als 0,1 μl).
- Montieren Sie die geladene Nadel auf die Mikroinjektionsvorrichtung, die an einem Mikromanipulator befestigt ist. Stellen Sie den Druck des Injektionsgeräts auf 250 kPa und den Ausgleichsdruck auf 25 kPa ein.
- Bricht die geladene Nadelspitze zurück, um eine scharfe Nadelkante zu erzeugen. Legen Sie ein quadratisches Deckglas von 15 mm x 15 mm x 1,5 mm auf die Oberseite eines Deckglases von 24 mm x 50 mm x 1,5 mm.
- Eine Kante des quadratischen Deckglases mit Halogenkohleöl 700 überziehen.
- Positionieren Sie die Nadel im Öl am Rand des 15 mm quadratischen Deckglases.
- Bürsten Sie mit einer Hand, um den Mikroskoptisch und das Deckglas zu führen, den Objektträger nach oben und entlang der Nadelkante, während Sie das Injektionspedal/die Injektionstaste drücken. Brechen Sie die Nadelspitze nach hinten, um den Fluss der Flüssigkeit aus der Nadel zu erhöhen. Erzielen Sie eine optimale Durchflussrate, indem Sie die Injektionsmischung entlang des Kantons der Nadel nach oben fließen lassen und ~1 Blase/s bilden.
- Bestätigen Sie, dass die L4-Würmer, die 12-24 Stunden vor der Mikroinjektion gepflückt wurden, am Tag der Injektion entwicklungsbedingte junge Erwachsene sind. Pflücken Sie die jungen erwachsenen Würmer auf eine NG-Agarplatte, die keine OP50-Bakterien enthält, und lassen Sie sie 5 Minuten lang herumkriechen. Dadurch wird die Menge der auf das Injektionskissen übertragenen Bakterien reduziert und das Verstopfen der Nadel minimiert.
- Platzieren Sie ein Agarose-Injektionskissen/Deckglas auf einem Dissektionszielfernrohr. Lege mit einem Wurmstocher eine kleine Spur Halogenkohlenwasserstofföl entlang einer Kante des Pads.
- Mit dem mit Öl beschichteten Schneckenpickel heben Sie mehrere Würmer von der NG-Agarplatte in die Ölspur. Positionieren Sie die Würmer mit einem feinen Haar, das an einer Pipette befestigt ist, wie z. B. einer Wimper oder einem Katzenbart, parallel und schieben Sie die Würmer vorsichtig in das Agarose-Pad. Bis Sie sich mit dem Mikroinjektionsverfahren vertraut gemacht haben, montieren und injizieren Sie jeweils nur einen Wurm.
HINWEIS: Die trockene Agarose leitet die Feuchtigkeit von den Würmern ab, wodurch sie am Pad haften bleiben. Folglich muss man schnell arbeiten, da die Würmer austrocknen können.
- Sobald sie in Position gebracht und am Pad befestigt sind, überlagern Sie die Würmer mit einigen weiteren Tropfen Halogenkohlenwasserstofföl (~20 μL) von der Spitze des Wurmpickels.
- C. elegans Gonaden-Mikroinjektion mit RNPs und Nachinjektionspflege
Das Mikroinjektionsprotokoll wurde von Mello und Fire übernommen und an anderer Stelle ausführlich beschrieben.
- Legen Sie das Deckglas mit den montierten Würmern auf das Injektionsmikroskop. Positionieren Sie die Würmer bei geringer Vergrößerung (5-faches Objektiv, 10-faches Okular) senkrecht zur Injektionsnadel.
- Wechseln Sie zu einer hohen Vergrößerung (40-faches Objektiv, 10-faches Okular), positionieren Sie die Nadel neben dem Gonadenarm entsprechend der Region in der Nähe der Zellkerne im mittleren bis späten Pachyten.
- Bewegen Sie die Nadel mit dem Mikromanipulator gegen den Wurm und drücken Sie die Nagelhaut leicht ein. Tippen Sie dann mit einer Hand auf die Seite des Mikroskoptisches, um die Nadel durch die Nagelhaut zu führen. Drücken Sie das Injektionspedal/den Injektionsknopf und füllen Sie langsam den Gonadenarm mit der Injektionsmischung und entfernen Sie die Nadel.
- Wiederholen Sie diesen Schritt mit dem anderen Keimdrüsenarm.
- Sobald die Würmer injiziert sind, entfernen Sie das Deckglas/Agarose-Pad und legen Sie es unter ein Präpariermikroskop.
- Verdrängen Sie mit einer gezogenen Kapillarpipette das Öl von den Würmern, indem Sie einen M9-Puffer über sie pipettieren. Führen Sie diese Behandlung durch, um die Würmer aus dem Agar zu lösen.
- Nach 10 Minuten, wenn die Würmer im Puffer herumschlagen, bringen Sie sie mit der gezogenen Kapillarpipette auf eine NG-Agar-Platte mit OP50-Bakterien. Stellen Sie die Platte 2-3 h lang auf 20 °C, bis sich die Würmer erholt haben und sich bewegen.
- Nach der Genesung werden die Würmer einzeln auf NG-Agarplatten mit OP50 übertragen und in einen 25 °C heißen Inkubator überführt.
- Lassen Sie die P 0-injizierten Würmer 3 Tage lang wachsen und legen Sie Nachkommen. Schirmen Sie den F1 Nachwuchs ab.
- Wenn Sie Co-CRISPR oder Co-Konversion verwenden, wählen Sie die Kandidatenwürmer für das Screening aus, basierend darauf, ob sie den mutierten Phänotyp des Referenzgens aufweisen. Diese markierten Würmer werden einzeln auf neue NG-Agarplatten mit OP50 übertragen und lassen Sie sie F2-Nachkommen bei 20 °C legen.
HINWEIS: Der Phänotyp, der für ein Co-CRISPR-Screening oder eine Co-CRISPR-Selektion verwendet wird, sollte eine frühe Abschätzung für den Erfolg der Cas9-Editierung liefern.
- Wenn der co-CRISPR-Phänotyp nicht vorhanden ist, mikroinjizieren Sie ein Positivkontrollplasmid, um die Mikroinjektionseffizienz zu verbessern.
HINWEIS: Zum Beispiel hilft die Aufnahme eines Plasmids in die Injektionsmischung, das für mCherry-markiertes MYO-2 kodiert, bei der Beurteilung der Injektionseffizienz. Würmer, die erfolgreich mit pCFJ90 injiziert wurden, haben einige Nachkommen mit fluoreszierenden Pharynxen.
- Untersuchen Sie die F 1-Würmer auf das Vorhandensein der gewünschten Bearbeitungen. Nehmen Sie die F1-Mutter in eine einzelne Vertiefung einer 96-Well-Platte, lysieren Sie sie und untersuchen Sie ihre DNA entweder durch insertspezifische PCR-Amplifikation, DNA-Sequenzanalyse oder Surveyor-Nuklease-Assay (CEL-1).
HINWEIS: Diese Assays können unter Verwendung einer Co-CRISPR/Co-Konversion oder anderer Screening- oder Selektionsregime durchgeführt werden.
