Neuartiger Tank Diving Assay: Eine Methode zur Untersuchung der angeborenen Stressreaktionen bei Zebrafischen

Zusammenfassung

Quelle: Chin J.S.R., et al. Verhaltensansätze zur Untersuchung von angeborenem Stress bei Zebrafischen. J. Vis. Exp. (2019)

Der Artikel beschreibt eine Verhaltensmethode zur Bewertung von Stress bei Zebrafischen. Als Reaktion auf Stress neigen Zebrafische dazu, auf dem Boden eines Aquariums zu schwimmen, bis der Stress abgebaut ist. Das Probenprotokoll beschreibt die schrittweise Methode zur Durchführung des Assays.

Protokoll

>1. Neuartiger Panzer-Testaufbau

1. Bereiten Sie ein 250-ml-Becherglas vor, das mit Wasser aus dem Fischsystem gefüllt ist, und mindestens zwei Fäkalientanks vor.
2. Am Morgen des Tests werden mindestens 10 adulte Testzebrafische, die für jede Versuchsbedingung (Kontrollen und experimentelle adulte Tiere) verwendet werden sollen, aus der Fischanlage in ein Auffangbecken gebracht, in den Verhaltensraum gebracht und mindestens eine Stunde lang akklimatisiert
   Anmerkung: Vor dem Experimentieren sollte eine Power-Analyse durchgeführt werden, aber in unseren Händen ist ein n = 10 in der Regel ausreichend, um eine statistische Signifikanz zu erkennen. Darüber hinaus sollte der Fäkalientank nicht mehr als fünf Personen pro Liter Wasser enthalten. Eine Akklimatisierung von einer Stunde ist ausreichend, da sich erwachsene Zebrafische innerhalb von 30 Minuten an ein neues Becken gewöhnen. Auch der Verhaltensrhythmus wird von zirkadianen Prozessen beeinflusst, und daher sollten experimentelle Replikationen, die an verschiedenen Tagen durchgeführt werden, innerhalb der gleichen Stunden durchgeführt werden. Wir führen alle Experimente in der Regel zwischen 11:00 und 18:00 Uhr durch.
3. Kennzeichnen Sie die Tanks so, dass der Zustand oder der Genotyp der Tiere für den Versuchsleiter blind ist.
   Anmerkung: Experimente können für den Experimentator leicht verblendet werden, indem die Tanks mit einem Buchstaben- oder Zahlensystem beschriftet werden (d. h. ein Tank ist mit "A", ein anderer mit "B" usw. beschriftet). Eine Partei, die nicht an den Experimenten beteiligt ist, beschriftet die Tanks mit einem solchen System und maskiert die Identitäten vor dem Experimentator, bis die Nachanalyse abgeschlossen ist.
4. Legen Sie mit einem Netz einen einzelnen Erwachsenen vorsichtig in das vorgefüllte Becherglas aus Schritt 1.1. Lassen Sie den erwachsenen Fisch 10 Minuten lang im Becherglas akklimatisieren.
   Anmerkung: Notieren Sie das Geschlecht des Erwachsenen, da es nach der Analyse wichtig sein kann, nach geschlechtsspezifischen Unterschieden zu suchen.
5. Nach der Eingewöhnung im Becherglas wird der Fisch in das neuartige Becken gesetzt (siehe unten), indem das Wasser und der erwachsene Fisch vorsichtig aus dem Becher ausgegossen werden.
   Anmerkung: Die Schritte in diesem Abschnitt beschreiben die Einrichtung des neuartigen Tank-Assays. Ein Diagramm des Endprodukts ist in Abbildung 1B dargestellt.
   1. Platziere den neuartigen Panzer in der Mitte des Tisches.
   2. Positionieren Sie die Infrarotleuchten hinter dem Tank und platzieren Sie die weiße Acrylplatte oder den Diffusorschirm zwischen dem Tank und der LED-Lichtquelle.
   3. Platzieren Sie den Diffusor so, dass er das von den LEDs kommende Licht maximal streut und die Intensität des Lichts ausreicht, um den neuartigen Tank zu beleuchten. Je näher die Platine an der Lichtquelle ist, desto heller sind die Lichter, aber desto weniger streut sie. Wenn Sie die Diffusorplatte hingegen nicht in der Nähe der Lichtquelle platzieren, wird die Lichtintensität verringert, das Licht jedoch besser verteilt.
   4. Füllen Sie das neuartige Becken zu etwa drei Vierteln mit Wasser aus dem Fischsystem.
      Anmerkung: Das Systemwasser wird durch Umkehrosmose von Leitungswasser erzeugt, gefolgt von einer Dosierung, die 900 ± 100 μS beträgt, einen pH-Wert von neutral (7,2) und eine Temperatur von 27 ± 1 °C aufweist.
   5. Befestigen Sie die Kamera an der Kamerahalterung und schließen Sie die Kamera an den Computer an. Öffnen Sie die Videoerfassungssoftware und stellen Sie die Kamera so ein, dass sie auf die Vorderseite des Panzers gerichtet ist, und stellen Sie sicher, dass der gesamte neuartige Panzer zu sehen ist und dass es keine verdeckten Bereiche im Video gibt. Stellen Sie den Tank und die Infrarotlichter so ein, dass der gesamte Tank ausreichend und gleichmäßig beleuchtet ist, wenn er durch die Kamera beobachtet wird.
      Anmerkung: Bevor man mit den Experimenten fortfährt, kann es oft sinnvoll sein, einen Probelauf durchzuführen, bei dem ein Video eines Fisches aufgenommen und eine Nachverfolgung durchgeführt wird. Dadurch wird sichergestellt, dass das Setup für das Experimentieren des Verhaltens ausreicht.
6. Nachdem Sie den Erwachsenen in das neuartige Aquarium eingeführt haben, starten Sie die Kameraaufnahme und entfernen Sie sich von der Einrichtung, um zusätzlichen Stress für den Fisch zu vermeiden.
7. Nachdem die Aufnahme beendet ist, nehmen Sie die Person aus dem neuen Tank und setzen Sie sie in einen neuen Fäkalienbehälter ein.
   Anmerkung: Es sollte ein anderer Fäkalientank als der in Schritt 1.2 verwendet werden, um wiederholte Tests an denselben Personen zu verhindern.

Ergebnisse

Abbildung 1. Diagramm des neuartigen Panzeraufbaus.(A) Abmessungen des trapezförmigen 1,8-Liter-Behälters aus der Sicht der Aufzeichnungsseite des Tanks. (B) Diagramm des Aufbaus einschließlich der Positionen der Infrarotlichter, der Kamera und der Barrieren, die verwendet werden, um menschliche Eingriffe zu minimieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kamera			Wir verwenden Point Grey Grasshopper3 USB-Kamera mit Objektiv von Edmund Optics.
Infrarot-Filter	Edmund Optik
Programm zur Videoerfassung			Verwenden Sie Programme wie Virtualdub oder FlyCapture, da die Erfassungs-Framerate eingestellt werden kann.
Infrarot-LED-Leuchten
Behälter für Assays	Aquaneering	Teilenummer ZT180	Größe: M3 1,8 Liter
Stativ und Klemme oder Standardstativ für Kamera
250mL Becherglas
Tracking-Software			Wir verwenden Ethovision XT 13 von Noldus Information Technology