1. Erzeugung primärer Mammosphären aus menschlichen Brustkrebszelllinien
HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte unter einer sterilen Kulturhaube durch.
- Bereiten Sie Mammosphärenmedien vor, die DMEM/F12 enthalten, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 U/ml Streptomycin. Bereiten Sie das vollständige Medium unmittelbar vor der Verwendung vor, indem Sie 20 ng/ml rekombinanten humanen epidermalen Wachstumsfaktor (EGF; Sigma), 10 ng/ml rekombinanter humaner basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF; F&E-Systeme) und 1x B27-Beilage.
- Aspirieren Sie Medien aus einem Kolben, der adhärente MCF-7- oder MDA-MB-231-Zellen (oder eine Brustkrebszelllinie Ihrer Wahl; 70-80 % Konfluenz) enthält, waschen Sie sie zweimal in 1x PBS und trypsinisieren Sie Zellen.
- Zellen bei 200 x g bei Raumtemperatur 5 min zentrifugieren. Überstand dekantieren und in 1-5 ml Mammosphärenmedium resuspendieren. Pipettieren Sie auf und ab und verwenden Sie bei Bedarf einen 40-μm-Filter für die Zellsiebkappe, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um sicherzustellen, dass sich eine einzelne Zellsuspension gebildet hat (wenn nicht, verwenden Sie eine 25-G-Nadel, um die Zellsuspension bis zu 3 Mal zu spritzen).
Falls erforderlich, Isolierung der - CD44+CD24-zellulären Untergruppe über FACS unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen CD24-Phycoerythrin (PE) und anti-CD44-fluorescein isothiocyanat (FITC)9. Alternativ können Sie eine solche Population mit einem magnetisch aktivierten Zellsortiersystem (MACS) mit kombinierten Anti-CD44- und Anti-CD24-Biotin-Mikrokügelchen gemäß den Anweisungen des Herstellers isolieren. Führen Sie eine positive Selektion mit LS-Säulen und eine negative Selektion mit LD-Säulen durch und bestätigen Sie die Phänotypen aller isolierten Zellen durch Durchflusszytometrie.
- Berechnen Sie die Anzahl lebensfähiger Zellen pro ml mit Trypanblau.
Anmerkung: Die Zellviabilität wird berechnet als die Anzahl der lebensfähigen Zellen geteilt durch die Gesamtzahl der Zellen innerhalb der Gitter auf dem Hämozytometer. Zellen, die Trypanblau aufnehmen, gelten als nicht lebensfähig. Das folgende Verfahren wird verwendet, um den Anteil lebensfähiger Zellen genau zu bestimmen.
- Bereiten Sie eine 0,4%ige Lösung von Trypanblau in PBS vor. 0,1 ml Trypanblau-Stammlösung zu 1 ml Zellen geben. Laden Sie ein Hämozytometer und untersuchen Sie es sofort unter einem Mikroskop bei geringer Vergrößerung. Zählen Sie die Anzahl der Zellen insgesamt und die Anzahl der blau färbenden Zellen. Lebensfähige Zellen = [1,00 – (Anzahl der blauen Zellen ÷ Anzahl der Gesamtzellen)] × 100.
- Um die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro ml Kultur zu berechnen, verwenden Sie die folgende Formel. Denken Sie daran, den Verdünnungsfaktor zu korrigieren.
Anzahl lebensfähiger Zellen × 104 × 1,1 = Zellen/ml-Kultur
- Resuspendieren Sie eine vorher festgelegte Menge an Zellen in 2 ml vollständigem Mammosphärenmedium in jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte mit extrem geringer Adhärentität. Die Aussaatdichte beträgt normalerweise 500-4.000 Zellen/cm 2 Zellen pro Well. Optional können 24-Well-Platten mit geringer Bindung verwendet werden, während Zellen mit der gleichen Dichte in 0,5 ml Medien ausgesät werden.
Anmerkung: Wir empfehlen die Optimierung der Aussaatdichte und der Kulturzeit für jede Zelllinie von Interesse.
- Inkubieren Sie extrem niedrig haftende 6-Well-Platten bei 37 °C und 5% CO2 für 5-10 Tage (abhängig von der Zelllinie und der Größe der Mammosphären), ohne die Platten zu stören, insbesondere während der Wachstumsphase der ersten 5 Tage.
