Transduktion zur Markierung von PDX-Tumorzellen: Einführung eines Lentivirus-exprimierenden fluoreszierenden Markers in die Tumorzelle in vitro

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Hanna, C., et al. Markierung von von Brustkrebspatientinnen stammenden Xenotransplantaten mit rückverfolgbaren Reportern für Tumorwachstums- und Metastasenstudien. J. Vis. Exp. (2016).

Das folgende Video beschreibt eine Technik der Transduktion zur Markierung von PDX-Tumorzellen (von Patienten stammende Xenotransplantate), die zur Einführung von Lentivirus-exprimierenden grün-fluoreszierenden Protein- und Luciferase-Reportern in die Tumorzelle in vitro verwendet wird.

Protokoll

1. Transduktion von PDX-abgeleiteten Tumorzellen

Dissoziierte Tumorzellen bei 300 g x 5 min zentrifugieren und in 2 ml Mammosphärenmedien resuspendieren. Zählung lebensfähiger Zellen mit Trypanblau-Ausschluss (Resuspendieren Sie verdaute Zellen in 5 ml Waschpuffer und zählen Sie sowohl lebensfähige als auch nicht lebensfähige Zellen mit Trypanblau-Ausschluss. Kurz gesagt, mischen Sie 50 μl Zellen und 50 μl Trypanblau und zählen Sie Trypanblau ohne Zellen mit einem Hämozytometer).
Bereiten Sie 10 ml Mammosphärenmedien mit 8 μg/ml Polybren vor (2 μl Stammpolybren pro ml Medium).
Bestimmen Sie das Volumen, das für 2 x 10⁵ lebensfähige Tumorzellen benötigt wird. Die Zellen werden 5 min lang bei 300 x g zentrifugiert und das Pellet in 2 ml polybrenhaltigem Medium resuspendiert. Platte: 2 x 10⁵ lebensfähige Tumorzellen pro Well in einer 6-Well-Gewebekulturplatte mit extrem geringer Adhärenz.
Anmerkung: Dies ist eine optimale Anzahl von Zellen, die für die Transduktion mit einem lentiviralen Vektor erforderlich ist.
Vorsicht!Lentivirale Partikel und alle Verbrauchsmaterialien, die mit lentiviralen Partikeln verwendet werden, sollten gemäß den institutionellen Verfahren für rekombinante DNA-Biogefahren gehandhabt werden.
Anmerkung: Die lentivirale Transduktion von primären Brustzellen begünstigt stark myoepitheliale Zellen, was zu einer schlechten Markierung von luminalen Zellen und der Selektion von Subpopulationen von Tumorzellen während der Markierung führen kann.
Inkubieren Sie das Virus mit 200 mU/ml Neuraminidase bei 37 °C für 1 Stunde vor der Transduktion, um die Bindung von Viruspartikeln an verschiedene primäre Zellsubpopulationen zu erhöhen und diese potenzielle Verzerrung zu korrigieren.
Lentivirale Partikel bei 10 MOI (2 x 10⁶ TU für 2 x 10⁵ lebensfähige Zellen) hinzufügen, wenn PDX-dissoziierte Zellen aus Lin+-Mauszellen depletiert oder mit EpCam+-Zellen angereichert werden. Lentivirale Partikel bei 30 MOI (6 x 10⁶ TU für 2 x 10⁵ lebensfähige Zellen) zugeben, wenn nicht angereicherte PDX-dissoziierte Zellen verwendet werden.
Anmerkung: Das erhöhte Trägheitsmoment ermöglicht eine effiziente Transduktion auch bei großen Mengen an Ablagerungen und abgestorbenen Zellen in Rohextrakten. Bewahren Sie eine Vertiefung mit unmarkierten Zellen auf, um die Lebensfähigkeit und Transduktionseffizienz zu kontrollieren.
Schwenken, um das Virus mit den Zellen zu vermischen. Inkubieren bei 37 °C, 5 % CO₂ für bis zu 96 Std. Geben Sie 24 Stunden nach der Transfektion 500 μl frisches Mammosphärenmedium hinzu. Zellen heften sich nicht an Platten, aspirieren keine Medien.

2. Bewertung der Transduktionseffizienz und Reimplantation markierter Zellen in immungeschwächten Mäusen

Überwachen Sie die Expression des tracecable marker (GFP) alle 24 Stunden mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 10-facher Vergrößerung.
Anmerkung: Die GFP-Expression kann bereits 24 Stunden nach der Infektion beobachtet werden, aber bei den meisten PDXs ist die GFP-Expression nach 72 Stunden deutlich sichtbar (Abbildung 1).
Schätzen Sie die Effizienz der Transduktion, indem Sie den Prozentsatz der GFP+-Zellen im gesamten Well bewerten.
Anmerkung: Da Kulturen Tumorzellen, restliche Stromazellen und tote Zellen in unterschiedlichem Maße enthalten, können Wells mit nur 10 % GFP+-Zellen in eine Wirtsmaus implantiert werden.
Übertragen Sie transduzierte Zellen von 6-Well-Platten in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Geben Sie 1 ml Mammosphärenmedium in die Vertiefung, um alle zurückgebliebenen Zellen zu sammeln. Auf Eis legen.
10 ml HBSS/Hepes in die transduzierten Zellen geben und bei 300 x g für 5 min, 4 °C zentrifugieren. Überstand vorsichtig aspirieren und in 50 μl Basalmatrix-Extrakt (BME) auf Eis resuspendieren.
Anmerkung: BME-Aliquote müssen 1 - 2 Stunden vor der Verwendung auf Eis aufgetaut werden. BME verfestigt sich bei Raumtemperatur; Bleiben Sie immer auf Eis.
Geben Sie BME-eingebettete Zellen in eine 0,5-ml-Insulinspritze, halten Sie sie auf Eis und bringen Sie sie zur Reimplantation in NSG-Mäuse in die Tiereinrichtung.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

figure-results-1
Abbildung 1: Verfolgung der Transduktionseffizienz in dissoziierten PDX-Zellen. A) PDX-dissoziierte Zellen, angereichert mit humanen Epithelzellen (Lin+-Depletion) 24 Stunden nach der Transduktion mit pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro lentiviralen Partikeln. B) PDX-dissoziierte Zellen aus einem separaten Experiment, ohne Epithelzellanreicherung, 72 Stunden nach der Transduktion mit pHAGE-EF1aL...