Co-Kultivierung von BC-Zellen: Kultivierung von Brustkrebszellen mit Knochenfragmenten zur Untersuchung der Proliferation von Krebszellen

Zusammenfassung

Quelle: Templeton, Z. S., et al. Methoden zur Kultivierung von Explantaten aus menschlichem Femurgewebe zur Untersuchung der Besiedlung von Brustkrebszellen in der metastasierten Nische. J. Vis. Exp (2015).

Dieses Video beschreibt die Kultivierung von Brustkrebszellen in der Nähe von Femurknochenexplantaten, um die Proliferation und Besiedlung von Krebszellen in einem menschlichen Knochengewebe-Explantat-Modellsystem zu messen.

Protokoll

1. Co-Kultivierung von Brustkrebszellen neben Knochenfragmenten, um die Proliferation von Brustzellen mit BLI zu messen

1. Vor dem Experiment wird eine Suspension mit 2 x 10⁵ Brustkrebszellen/50 μl hergestellt und Knochenwachspfropfen zur Immobilisierung von Knochenfragmenten in Kultur vorbereitet. Schneiden Sie eine P200-Mikropipettenspitze in 3 Stücke und verwenden Sie das schmale Ende des größten Stücks in einer "Ausstechform"-Manier, um kleine (~35 mg) Stücke Knochenwachs zu schneiden. Verwenden Sie das breite Ende des kleinsten Stücks, um die Knochenwachsstopfen zur Aufbewahrung in eine Petrischale zu werfen.
2. Legen Sie ein Stück Knochenwachs auf die 12-Uhr-Position jeder Vertiefung und drücken Sie es vorsichtig mit einem steril behandschuhten Zeigefinger nach unten.
3. Pipettieren Sie 50 μl Zellsuspension mit 1 x 10⁵ Brustkrebszellen in DMEM-10% FBS + Pen-Strep in die Mitte jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte. (Alternativ können Sie die Zellen in einem dispergierten Muster aussetzen, falls gewünscht.) Stellen Sie die Platte für 45 Minuten in einen 37 °C heißen Gewebekultur-Inkubator, um die Zelladhäsion zu fördern.
4. Legen Sie 1 Knochenfragment auf 1 Stück Knochenwachs für jede Versuchsvertiefung und üben Sie leichten Druck mit dem Rongeur aus, um es zu sichern. Führen Sie Experimente in dreifacher Ausfertigung durch, so dass 3 Knochenfragmente einer bestimmten THR-Probe in die oberen drei Vertiefungen gegeben werden, während die unteren drei Vertiefungen Knochenwachs nur als Kontrollen enthalten.
5. Geben Sie mit einer 5-ml-Pipette vorsichtig und langsam 5 ml DMEM-10 % FBS an die Seite jeder Vertiefung, um ein Verschieben der Brustzellen oder Knochenfragmente zu vermeiden. Stellen Sie die Platte für 20-24 Stunden in einen 37 °C heißen Gewebekultur-Inkubator.
6. Um eine Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) durchzuführen, nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und fügen Sie jedem Well Luciferin-Substrat (um eine Konzentration von 300 μg/ml zu erreichen) hinzu. Bilden Sie die Platte sofort auf einer IVIS-Bildgebungsplattform mit den folgenden Parametern ab: Blende von 1, Small Binning, Belichtungszeit von 1 Sek., Stufe D. Messen Sie die Signalintensität jeder Vertiefung sowie die durchschnittliche Strahldichte (Photonen/Sekunde/Quadratzentimeter/Steradiant).
7. Verwenden Sie Bildgebungssoftware, um Regions of Interest (ROI) zu definieren, um die durchschnittliche Strahldichte für alle Versuchs- und Kontrollwells zu quantifizieren. Exportieren Sie durchschnittliche Strahldichtewerte in eine Excel-Tabelle, um Statistiken durchzuführen und Diagramme zu erstellen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM (1X) + GlutaMAX-l	Lebenstechnologien	Tel.: 10569-010	Ergänzen Sie alle DMEM mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Pen/Strep
Fötales Rinderserum	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 16000-044
Penicillen Streptomycin	Lebenstechnologien	Nr. 15140-122
D-Luciferin Glühwürmchen, Kaliumsalz 5 g (30 mg/ml)	Lebenstechnologien	Nr. L-8220
6 Well TC-behandelte Zellkulturcluster	Corning Incorporated	3516
Friedman-Pearson Rongeur	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 16021-14
Knochenwachs	Chirurgische Spezialitäten Corporation	903
IVIS 50 Imaging-Plattform	Caliper Life Sciences/PerkinElmer
MCF-7 Brustkrebszellen	ATCC	HTB-22
MDA-MB-231 Brustkrebszellen	ATCC	HTB-26

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