Organkonditioniertes Medium: Erzeugung von Medium aus entnommenen Organzellen für metastasierende Krebsstudien

Zusammenfassung

Quelle: Piaseczny, M. M., et al. Generierung organkonditionierter Medien und Anwendungen zur Untersuchung organspezifischer Einflüsse auf das metastasierende Verhalten von Brustkrebs. J. Vis. exp.(2016).

Dieses Video beschreibt eine Methode zur Erzeugung eines organkonditionierten Mediums, das aus der Leber der Maus gewonnen wurde. Dieses Modellsystem kann verwendet werden, um aus Organen gewonnene lösliche Faktoren und ihre Auswirkungen auf den Organtropismus und das Metastasierungsverhalten von Krebszellen zu identifizieren und zu untersuchen.

Protokoll

>1. Erzeugung von lungen- und gehirnkonditionierten Medien

1. In einer sterilen Gewebekulturhaube werden PBS-Röhrchen, die Lunge oder Gehirn enthalten, dreimal umgedreht, um Blutreste aus Organen zu entfernen, und PBS-haltiges Blut aspiriert. Wiederholen Sie den Vorgang mit frischem, kaltem PBS, bis die Lösung klar und ohne Anzeichen von Blut erscheint.
2. Lungen und Gehirn in separate 60 mm2 große Petrischalen aus Glas geben. Mit zwei sterilen Skalpellklingen werden Lungen oder Gehirne durch wiederholtes Hin- und Herschneiden zerkleinert, bis die Gewebefragmente eine Größe von ca. ~ 1 mm3 haben.
3. Bestimmen Sie die Menge an Medium, die benötigt wird, um Gewebefragmente aus der berechneten Gewichtsdifferenz zu resuspendieren.
   Anmerkung: Lungen- und Hirngewebe werden durch Resuspension in einem Medien-Gewebe-Verhältnis von 4:1 (Vol/Wt) gewichtsnormalisiert.
4. Resuspendieren Sie Gewebefragmente in einem geeigneten Volumen (zuvor in Schritt 1.3 bestimmt) von Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM):F12-Medium, ergänzt mit 1x konzentriertem Mitogen-Supplement und Penicillin (50 μg/ml)/Streptomycin (50 μg/ml).
5. Geben Sie resuspendierte Lungen- oder Hirngewebefragmente in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte.
6. Inkubieren Sie Gewebefragmente 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 in Medien. Nach der Inkubation werden konditionierte Medien für jedes Gewebe gesammelt und weiter verdünnt, indem drei äquivalente Volumina frischer Medien in ein konisches 50-ml-Röhrchen gegeben werden.
7. Zentrifugieren Sie 15 Minuten lang bei 1.000 x g in verdünntem konditioniertem Medium für jedes Organ bei 4 °C, um große Gewebereste zu entfernen. Sammeln Sie den Medienüberstand und filtern Sie ihn durch einen 0,22-μm-Spritzenvorsatzfilter.
8. Poolen Sie konditionierte Medien aus jedem Organ (d. h. Lunge mit Lunge und Gehirn mit Gehirn) von mehreren Mäusen, um die Variabilität von Maus zu Maus zu berücksichtigen. Aliquotieren und lagern Sie konditionierte Medien bis zur Verwendung bei -80 °C.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	ThermoFisher Scientific	Nr. 10010-023	Steril halten
60 mm2 Petrischalen aus Glas	Sigma-Aldrich	CLS7016560	Steril halten
DMEM:F12	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 21331-020	Vor Gebrauch im 37 °C warmen Wasserbad erwärmen, steril halten
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Lebenstechnologien	Nr. 15140-122	Steril halten
50 ml konische Röhrchen	Thermo Scientific (Nunc)	339652	Steril halten
0,22 μm Spritzenvorsatzfilter	Sigma-Aldrich	Z359904	Steril halten
6-Well-Gewebekulturplatten	Thermo Scientific (Nunc)	140675	Steril halten
Skalpell-Klingen	Fisher Scientific	S95937A	Steril halten