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>1. Validierung von Lungenmetastasen mittels Tusche-Inflation von tumortragenden Lungen
HINWEIS: Um die Ergebnisse der Luziferase lebenden Tumorbildgebung zu validieren, führen Sie eine Tusche-Inflation von tumortragenden Mauslungen durch, um Tumorknoten zu quantifizieren. 4T1-Zellen metastasieren auch in andere Organe und Gewebe (Abbildung 1) und daher sollte bei Bedarf eine histologische Untersuchung dieser Organe durchgeführt werden, um die Tumormetastasierung zu validieren. Dieses Protokoll verwendet die Lungenmetastasierung als Beispiel.
- Halten Sie Mäuse zur Euthanasie in ihrem bestehenden Käfig. Wenn Sie mit anderen Tieren untergebracht sind, bringen Sie die Mäuse, die nicht eingeschläfert werden, in einen anderen Käfig.
- Entfernen Sie den Käfigfilterdeckel und ersetzen Sie ihn durch den CO2-Filterdeckel. Schalten Sie die komprimierte CO2-Gasflasche (100%) ein, die mit dem oberen CO2-Filter verbunden ist. Stellen Sie die Durchflussmenge auf 2 l/min ein und lassen Sie CO2 mindestens 10 min eingeschaltet. Wenn die Mäuse nach Ablauf von 10 Minuten noch atmen, lassen Sie das CO2 mindestens 1 Minute eingeschaltet, nachdem die Mäuse aufgehört haben zu atmen. Schalten Sie die Steuerung der CO2-Flasche und den Durchflussmesser aus. Warten Sie weitere 3 Minuten und entfernen Sie den Filterdeckel.
- Lege die geopferte Maus auf den Rücken auf eine Styroporplatte. Stecken Sie die Beine fest, um einen ungehinderten Zugang zur Luftröhre zu gewährleisten. Besprühen Sie die Mäuse mit 70% Ethanol.
- Schneiden Sie mit einer Schere entlang der Mittellinie des Mittelbauchs der Maus durch den Brustkorb und nach oben in Richtung der Speicheldrüsen. Beobachte die Luftröhre. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gewebe um die Luftröhre herum zu entfernen, um die Luftröhre freizulegen.
- Fädeln Sie eine Pipettenspitze unter die Luftröhre. Halten Sie die Spitze mit einer Hand fest und heben Sie die Luftröhre vorsichtig nach oben und vom Körper weg.
- Drehen Sie die Plattform, während Sie die Maus halten, um 180°. Verwenden Sie eine 1/2 CC 27 G 1/2 Tuberkulinspritze, um Tusche (10 % Tusche und 0,1 % Ammoniumhydroxid) über die Luftröhre in die Lunge zu injizieren. Blasen Sie die Lunge vollständig mit Tinte auf, bis ein starker Widerstand zu spüren ist.
- Verwende eine Schere, um die Luftröhre zu durchtrennen. Halten Sie die Maus mit einer Pinzette fest, führen Sie eine weitere Pinzette unter die Lunge ein und ziehen Sie die Lungenlappen aus der Maus heraus. Spülen Sie die Lunge kurz in einem Becherglas mit Wasser aus.
- Übertragen Sie die Lunge in einem chemischen Abzug in ein Szintillationsfläschchen aus Glas, das 3 ml Fekete-Lösung (50 % Ethanol, 6 % Formaldehyd und 3 % Eisessig) enthält. Verschließen Sie das Fläschchen, um ein Verdampfen der Lösung zu verhindern.
Anmerkung: Das Gewebe kann unbegrenzt in Feketes Lösung gelagert werden.
- Nach einigen Minuten sind Tumorknötchen als weiße Punkte auf der schwarzen Lunge zu erkennen (Abbildung 1). Der weiße Tumorknoten ist mit den Augen sichtbar. Übertragen Sie die Lunge in eine Schüssel in einem Abzug und zählen Sie die Anzahl der weißen Flecken. Jeder weiße Fleck stellt einen einzelnen metastasierten Tumorknoten dar.
