Mechanische Dissoziation: Eine Methode, um lebensfähige Zellen aus einem Gewebe zu gewinnen

Zusammenfassung

Quelle: Garaud et. al., Ein einfaches und schnelles Protokoll zur nicht-enzymatischen Dissoziation frischer menschlicher Gewebe für die Analyse infiltrierender Lymphozyten. J. Vis. Exp. (2014).

Dieses Video beschreibt die nicht-enzymatische Dissoziation von frischem menschlichem Gewebe, um lebensfähige Zellen zu erhalten. Die Technik wird für die qualitative und quantitative Analyse von CD45-positiven Zellen (Lymphozyten/Leukozyten) verwendet, die in verschiedenen normalen und bösartigen menschlichen Geweben vorhanden sind.

Protokoll

1. Vorbereitung des Gewebehomogenats

Das
1. präparierte resezierte Gewebe (bösartiges und normales Gewebe, das aus dem Operationssaal reseziert wurde) wird im Pathologielabor von geschultem Personal zur sofortigen Entnahme durchgeführt. Tumor-, NANT- (so weit wie möglich vom Tumor entfernt) und normale Gewebefragmente werden routinemäßig innerhalb von 1 - 3 Stunden nach der chirurgischen Exzision in einem BSL2-Labor unter Verwendung der für menschliches Gewebe üblichen Biosicherheitsverfahren verarbeitet. Ein Flussdiagramm des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.
2. Wiegen Sie alle Gewebefragmente (normal, NANT und Tumor) und messen Sie die Länge, Breite und Höhe (Länge x Breite x Höhe). Dies ist ein wichtiger Schritt für die anschließende Normalisierung von Zellsubpopulationen, extrahierter RNA usw.
   Anmerkung: Der Bereich der Probengröße liegt zwischen 100 und 10.000 mm³, wenn möglich ohne Fett.
3. Drucken Sie das Tumorfragment für die H&E-Färbung auf einen Objektträger, um zu überprüfen, ob das Gewebe tatsächlich Teil des Tumors ist.
   1. Drücken Sie dazu einen Objektträger aus Glas auf das Tumorfragment und üben Sie einige Sekunden lang sanften Druck mit den Fingern aus.
   2. Fixieren Sie den Objektträger 2 Minuten lang mit Isopropanol, gefolgt von einem Waschschritt in Wasser. Färben Sie das Gewebe 30 Sekunden lang mit Mayer-Hämatoxylin gegen.
   3. Waschen Sie die Rutsche in sechs Bädern mit Wasser. Färben Sie Phloxin B 2% für 15 Sekunden.
   4. Waschen Sie sich in einem Bad mit Wasser, gefolgt von vier Bädern Isopropanol und beenden Sie mit einem Bad mit Wasser.
   5. 1 min in Isopropanol inkubieren und abtropfen lassen. In zwei Bädern mit Xylol klar.
   6. Mit Einbettmedium auf Xylolbasis einbinden. Untersuchen Sie die Tumorzellularität (Abbildung 2).
      Anmerkung: Hauptsächlich kleben Tumorzellen an dem geprägten Objektträger – die Stroma-, Lymph- oder Fettzellen bleiben selten zurück und lassen Lücken zwischen den Tumorzellen (Abbildung 2).
4. Das Gewebefragment wird in eine kleine Kulturschale gegeben, die 1 ml des chemisch definierten, serumfreien hämatopoetischen Zellmediums (im Folgenden als Medium bezeichnet) bei Raumtemperatur enthält, und es mit einem sterilen Skalpell in kleine Stücke (~1 - 2 mm²) würfeln.
5. Übertragen Sie alles (Gewebefragmente + Medium) in ein mechanisches Dissoziator-C-Rohr.
6. Spülen Sie die Petrischale und das Skalpell mit 2 ml Medium mit einer Pasteurpipette aus und geben Sie dieses in das C-Röhrchen (Volumen des Mediums für die Dissoziation = 3 ml).
7. Verwenden Sie das mechanische Dissoziatorprogramm A.01 für C-Röhrchen (das schonendste Programm), um die Gewebefragmente in eine Einzelzellsuspension zu homogenisieren. Setzen Sie die C-Röhre in das Gerät ein und führen Sie das Programm zweimal hintereinander aus (ein Zyklus = 25 Sekunden).
   Anmerkung: Dieses Homogenisierungsverfahren wurde für menschliches Brustgewebe etabliert und validiert, andere Tumor- oder Gewebearten müssen möglicherweise ein anderes Programm verwenden und sollten zuerst getestet werden.
8. Das C-Röhrchen wird aus dem Apparat genommen und das Homogenat direkt in ein 40-μm-Zellsieb umgefüllt, das auf einem 50-ml-Röhrchen sitzt. Übertragen Sie die im C-Röhrchen verbleibende Flüssigkeit mit der gleichen Pasteurpipette wie in Schritt 1.6 in das Zellsieb.
9. Füllen Sie die gefilterte Flüssigkeit mit einer 1-ml-Mikropipettenspitze in ein 15-ml-Röhrchen. Bewahren Sie das Zellsieb und seine 50-ml-Tube vorübergehend auf.
10. Spülen Sie das C-Röhrchen mit weiteren 3 ml Medium und geben Sie dieses mit der gleichen Pasteurpipette wie in Schritt 1.6 in das Zellsieb, das noch auf dem 50-ml-Röhrchen sitzt. Drücken Sie eine maximale Menge der Restflüssigkeit, die im nicht homogenisierten Gewebe eingeschlossen ist, in das 50-ml-Röhrchen, indem Sie es vorsichtig mit einer sauberen Pasteur-Pipette oder einer 1-ml-Spitze um das Sieb herum bewegen, die anschließend weggeworfen wird, um eine Kontamination des Eluats zu vermeiden.
11. Legen Sie das Zellsieb kopfüber auf das Original C-Röhrchen und spülen Sie es mit 3 ml Medium aus, so dass das nicht homogenisierte Gewebe wieder in das C-Röhrchen fällt.
12. Wie in Schritt 1.7 für zwei Zyklen des Programms A.01 erneut homogenisieren.
13. Gießen Sie dieses zweite Homogenat durch das Zellsieb, das auf dem 50-ml-Röhrchen sitzt, spülen Sie das C-Röhrchen erneut mit 3 ml Medium (wie in Schritt 1.10) und geben Sie es mit der Pasteurpipette in das Zellsieb, das auf dem 50-ml-Röhrchen sitzt, und drücken Sie erneut eine maximale Menge Flüssigkeit aus dem im Zellsieb eingeschlossenen Bindegeweberest
.
14. Zu diesem Zeitpunkt befindet sich ein Volumen von ~2,5 ml in der 15 ml Tube und ~9 ml in der 50 ml Tube.

2. Trennung des Gewebeüberstands und der Zellen

1. Zentrifugieren Sie die Homogenate in den 15 ml und 50 ml Röhrchen für 15 min bei 600 x g bei Raumtemperatur.
2. Das SN aus der 15 ml Tube in ein sauberes Röhrchen umfüllen und bei 4 °C zwischenlagern. Dieser Überstand = Primärtumor, NANT oder Normalgewebe SN (Endvolumen 2,5 ml) wird anschließend vor der Lagerung bei -80 °C für zukünftige Analysen abgeklärt und aliquotiert (siehe unten).
3. Entsorgen Sie den Überstand aus der 50-ml-Tube.
4. Resuspendieren Sie beide Zellpellets vorsichtig in einem Endvolumen von 1 ml Medium. Brechen Sie zuerst kurz das Zellpellet vorsichtig in beide Röhrchen (indem Sie das Röhrchen auf eine harte Oberfläche klopfen). Resuspendieren Sie das lose Zellpellet in den 50 ml mit 500 μl Medium und überführen Sie diese Zellsuspension in das 15 ml Röhrchen, um das zweite Pellet zu resuspendieren. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal mit den zweiten 500 μl Medium, um eine maximale Rückgewinnung der Zellen zu erzielen.
5. 10 μl der Zellsuspension in ein kleines Röhrchen umfüllen, mit 10 μl Trypanblau (Verdünnung 1:1) mischen und die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer zählen.
   Anmerkung: Zu diesem Zeitpunkt kann auch ein Teil der Zellsuspension durch Durchflusszytometrie analysiert werden, um die Zellgröße, die Granularität und, falls gewünscht, eine begrenzte Anzahl von Subpopulationsmarkern für eine genauere Beurteilung der relativen Zellverteilung im Homogenat vor umfangreichen Analysen oder Experimenten zu bewerten. Alle Analysen mittels Durchflusszytometrie beinhalten eine CD45-Markierung zur Normalisierung von Subpopulationen.
6. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur pelletiert. Die Zellen aus dem Tumor, NANT oder normalem Gewebe sind nun bereit für die weitere Reinigung oder Analyse. Diese zusätzlichen Schritte sind am besten, wenn sie am selben Tag wie die Operation durchgeführt werden.
   Anmerkung: Für die durchflusszytometrische Analyse, aber nicht für die Zellsortierung, sollten die verbleibenden roten Blutkörperchen nach der Antikörpermarkierung lysiert werden, indem 0,4 ml Erythrozyten-Lysepuffer zum Zellpellet gegeben, sofort 1 Sekunde lang vortexiert und vor der Analyse mindestens 10 Minuten bei Raumtemperatur (lichtgeschützt) inkubiert werden.

3. Klärung des Gewebeüberstands

1. Die 1,5 ml Röhrchen mit Gewebe SN bei 15.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren.
2. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu berühren oder zu stören. In ein sauberes Röhrchen (oder Röhrchen) umfüllen, je nach Anzahl und Volumen der gewünschten Aliquots.
3. Lagern Sie den Überstand für die zukünftige Verwendung bei -80 °C.

Ergebnisse

Abbildung 1: Ablaufdiagramm des Protokolls.Unser Verfahren zur Aufbereitung von frischem menschlichem Gewebe und einige analytische Ansätze, die anschließend zur Beurteilung von Lymphozyten verwendet werden können, die in menschliches Gewebe eindringen, werden gezeigt.

Abbildung 2: H&E-gefärb...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
GentleMacs Dissoziator	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-093-235	BD Medimachine ist in etwa gleichwertig
Zentrifuge 5810 R	Eppendorf		oder eine andere Standard-Tischzentrifuge
Zentrifuge 5417 R	Eppendorf		oder eine andere Standard-Mikrozentrifuge
Esco Klasse II A2 Biosicherheitswerkbank	ESCO weltweit		oder eine andere Standard-BSL2-Haube
Inverses Mikroskop	Nikon eclipse TS100		oder ein anderes Mikroskop, das für ein Hämazytometer kompatibel ist
Bürker Kammer Marienfield		Artikel-Nr.: 640210	oder ein anderes Standard-Hämazytometer
Navios Durchflusszytometer	Beckman Coulter		oder ein anderes Durchflusszytometer (8-10 Farben empfohlen)
GentleMacs C-Röhre	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-096-344	BD Medimachine verwendet Filcon
Zellkulturschale	Sarstedt	72.710	oder andere nichtpyrogene Kunststoffwaren
Einweg-Skalpell	Swann-Morton	510	oder steriles Standard-Skalpell zum Einmalgebrauch
BD Zellsieb 40 μm	Becton Dickinson	Tel.: 734-0002	oder andere nichtpyrogene Kunststoffwaren
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	Artikel-Nr.: 352070	oder andere nichtpyrogene Kunststoffwaren
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	oder andere nichtpyrogene Kunststoffwaren
BD FACS Röhrchen 5 ml	Becton Dickinson	352008	oder andere nichtpyrogene Kunststoffwaren
Sterile Pasteurpipette 5 ml	VWR	Nr. 612-1685	oder andere nichtpyrogene Kunststoffwaren
Mikrofuge Röhrchen 1,5 ml	Eppendorf	Tel.: 7805-00	oder andere nichtpyrogene Kunststoffwaren
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	serumfreies Medium empfohlen
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Lonza	BE17-516F	Standard physiologisches PBS
Trypan-Blau	VWR	17942E	oder ein anderer lebenswichtiger Fleck