Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien: Eine Methode zum Testen der Auswirkungen neuartiger Verbindungen auf die Proliferation von Krebszellen

Zusammenfassung

Quelle: Horibata A. et. al., Verwendung des Soft Agar Colony Formation Assay zur Identifizierung von Inhibitoren der Tumorigenität in Brustkrebszellen. J. Vis. Exp. (2015).

Dieses Video beschreibt einen Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien, um die Auswirkungen eines PADI-Enzyminhibitors und BB-Cl-Amidin auf die Tumorigenität von Brustkrebs in vitro zu testen. Dieser Assay ermöglicht auch die quantitative Beurteilung des Zelltransformationspotenzials im Rahmen genetischer Störungen.

Protokoll

1. Herstellung von 3%iger 2-Hydroxyethyl-Agarose

1. In eine saubere, trockene 100-ml-Glasflasche werden 0,9 g 2-Hydroxyethyl-Agarose (Agarose VII) und anschließend 30 ml destilliertes Wasser gegeben.
2. Die Mischung 15 Sekunden lang in der Mikrowelle erhitzen und vorsichtig schwenken. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens drei weitere Male, bis sich das Agarosepulver vollständig aufgelöst hat.
3. Autoklavieren Sie die lösungshaltige Flasche für 15 min.
4. Lassen Sie die Agaroselösung vor der weiteren Verwendung auf RT abkühlen. Speichern Sie die Lösung bei RT.

2. Vorbereitung der unteren Schicht: 0,6% Agarose-Gel

1. Mehrere 5 ml und 10 ml Pipetten in einem 37 °C heißen Inkubator vorwärmen, um zu verhindern, dass sich die Agarose bei der Handhabung in der Pipette verfestigt.
2. Lösen Sie den Flaschendeckel teilweise und erhitzen Sie die vorgefertigte 3%ige 2-Hydroxyethyl-Agarose-Lösung 15 Sekunden lang. Dann die Lösung vorsichtig schwenken und weitere 15 Sekunden in der Mikrowelle erhitzen
   Vorsicht: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Agaroselösung schwenken, da die Lösung an der Luft aufsteigt und überschwappen kann.
3. Wenn sich feste Gelreste in der Flasche befinden, noch einige Sekunden in der Mikrowelle erhitzen.
4. Bewahren Sie die Flasche mit der Agaroselösung während der nächsten Schritte in einem 45 °C heißen Wasserbad auf, um ein vorzeitiges Erstarren der Agaroselösung zu verhindern.
5. Erwärmen Sie MCF10DCIS Medien in einem 37 °C warmen Wasserbad.
   Anmerkung: MCF10DCIS Medium besteht aus DMEM/F12, 5% Pferdeserum, 5% Penicillin-Streptomycin.
6. 3 ml der 3%igen Agaroselösung mit den vorgewärmten Pipetten in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen überführen.
7. Geben Sie sofort 12 ml warmes MCF10DCIS Medium hinzu und drehen Sie das konische Röhrchen vorsichtig um, um die Agarose mit dem Medium zu mischen. Versuchen Sie, keine Blasen zu bilden, da dies die spätere Zählung des Volkes beeinträchtigen wird.
8. Geben Sie vorsichtig 2 ml dieser Mischung in jede Vertiefung einer 6-Well-Kulturplatte, ohne Luftblasen zu bilden.
9. Die 6-Well-Kulturplatte wird 1 Stunde lang horizontal auf einer ebenen Fläche bei 4 °C inkubiert, damit sich die Mischung verfestigen kann.
10. Nachdem die Mischung fest geworden ist, stellen Sie die Platte für 30 Minuten in einen 37 °C heißen Inkubator. Die untere Schicht ist nun einsatzbereit.

3. Vorbereitung der zellhaltigen Schicht: 0,3% Agarose-Gel

1. MCF10DCIS Zellen trypsinisieren und auf eine Zellkonzentration von 4 x 10⁴ /ml verdünnen.
2. Nehmen Sie 2 ml der 3%igen Agarose mit vorgewärmten Pipetten und geben Sie sie in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen.
3. Geben Sie sofort 8 ml MCF10DCIS Medium in das konische Röhrchen und drehen Sie es vorsichtig um, um die Agarose mit dem Medium zu vermischen. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen.
4. 2 ml der MCF10DCIS Zellen (4 x 10⁴ /ml) entnehmen und mit BB-CLA (0 μM (DMSO) oder 1 μM) behandeln.
5. Mischen Sie die Zellen in einer 1:1-Verdünnung mit der 0,6%igen Agarose.
6. Nehmen Sie 1 ml des Zell-Agarose-Gemisches und geben Sie es vorsichtig auf die untere Schicht der 6-Well-Kulturplatte (2 x 10⁴ Zellen/ml).
7. Stellen Sie die 6-Well-Kulturplatte mindestens 15 Minuten lang horizontal bei 4 °C auf eine ebene Fläche, damit sich die oberste Schicht verfestigen kann.
8. Nachdem die Mischung fest geworden ist, stellen Sie die Platte für eine Woche in einen 37 °C heißen Inkubator, bevor Sie die Futterschicht hinzufügen.

4. Vorbereitung der Feeder-Schicht: 0,3% Agarose-Gel

1. Die vorgefertigte 3%ige 2-Hydroxyethyl-Agarose-Lösung 15 Sekunden lang in die Mikrowelle stellen, die Lösung vorsichtig schwenken und weitere 15 Sekunden in der Mikrowelle erhitzen.
2. Die Flasche mit der Agaroselösung in einem 45 °C warmen Wasserbad äquilibrieren.
3. Erwärmen Sie die MCF10DCIS Medien in einem 37 °C warmen Wasserbad.
4. Mischen Sie 1 ml 3%ige Agaroselösung mit 9 ml warmem MCF10DCIS Medium in ein konisches 50-ml-Röhrchen und drehen Sie es vorsichtig um, um die Agarose mit dem Medium zu vermischen. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen.
5. Behandeln Sie das Gemisch mit BB-CLA (0 μM (DMSO) oder 1 μM).
6. Geben Sie vorsichtig 1 ml dieser Mischung (ohne Blasenbildung) in jede Vertiefung der 6-Well-Kulturplatte, die die untere und die weiche Schicht enthält.
7. Stellen Sie die 6-Well-Kulturplatte mindestens 15 Minuten lang waagerecht auf eine ebene Fläche bei 4 °C, damit sich die Mischung verfestigen kann.
8. Nachdem die Feederschicht erstarrt ist, stellen Sie die Platte in einen 37 °C heißen Inkubator.
9. Wiederholen Sie diesen Fütterungsvorgang wöchentlich, indem Sie 1 ml 0,3 % Agarose/Medium/Behandlungslösung auf die vorhandene Futterschicht auflegen, um die Zellen mit neuen Medien aufzufüllen, bis eine Koloniebildung beobachtet wird.
   Anmerkung: Agar in der Weich- und Feederschicht ist sehr weich und daher diffundieren die zugesetzten Nährstoffe aus der Feederschicht leicht in die zellhaltige Schicht, um die Zellen zu erreichen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zeiss Axiopot	Carl Zeiss Mikroskopie	1021859251
Inverses Mikroskop	Olymp	CKX41
DMEM/F-12	Lonza BioWhittaker	12-719F
HyClone Donor Serum für Pferde	Fisher Scientific	SH30074.03
Penicillin Streptomycin	Lebenstechnologien	Nr. 15140-122
2-Hydroxyethylagarose: Typ VII, niedrige Geliertemperatur	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 39346-81-1