Schwanzveneninjektion: Eine Methode zur Verabreichung von Krebszellen für Metastasierungsstudien in einem Mausmodell

Zusammenfassung

Quelle: Warren et al., Kombinierte Verwendung von Schwanzvenenmetastasen-Assays und Echtzeit-In-vivo-Bildgebung zur Quantifizierung der metastasierenden Besiedlung und Belastung von Brustkrebs in der Lunge. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video beschreibt eine Technik zur Injektion markierter Krebszellen mittels Schwanzveneninjektion in ein Mausmodell. Darüber hinaus überwachen wir die Metastasierung und das Wachstum von Brustkrebs mit Hilfe von Echtzeit-In-vivo-Bildgebung von lebenden Tieren.

Protokoll

1. Schwanzveneninjektion von markierten Krebszellen

HINWEIS: Schritt 1.2.4 wurde für 4T1-Zellen optimiert, die in syngenen BALB/c-Mäusen wachsen. Werden andere Krebszelllinien und Mausstämme verwendet, sollten zunächst die Anzahl der injizierten Zellen und die Länge des Assays optimiert werden.

1. Expandieren Sie die in Schritt 2 erzeugten 4T1-Zelllinien auf zwei 15-cm-Schalen in vollständigem Wachstumsmedium, so dass überschüssige Zellen am Tag der Injektion verfügbar sind.
2. Bereiten Sie die Zellen wie folgt für die Schwanzveneninjektion vor:
   1. Saugen Sie das Medium an und spülen Sie die Zellplatten mit 1x PBS.
   2. Trypsinisieren Sie die Zellen mit 5 ml Trypsin pro 15 cm Platte für 2-5 Minuten (die Zellen sollten den Boden der Vertiefung frei abspülen). Übertragen Sie alle Zellen in ein konisches Röhrchen. Waschen Sie die verbleibenden Zellen aus der Gewebekulturschale mit genügend vollständigem Wachstumsmedium, um das Trypsin zu löschen, und geben Sie die Wäsche in dasselbe konische Röhrchen.
   3. Zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzähler, um die Gesamtzellzahl zu bestimmen.
   4. Zentrifugieren Sie die Zellen 3 Minuten lang bei 122 x g, aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1x PBS in der gewünschten Konzentration. Hier werden in jede Maus 2,5 x 10⁴ Zellen in 100 μl PBS injiziert, so dass die Zellen bei 2,5 x 10⁵ Zellen/ml resuspendiert werden. Bewahren Sie die Zellsuspensionen bis zur Injektion auf Eis auf.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Zeitspanne zwischen der Trypsinisierung der Zellen und der Schwanzveneninjektion auf etwa 1 Stunde zu begrenzen.
3. Injizieren Sie 4T1-Zellen aus Schritt 1.2.5 über die laterale Schwanzvene wie folgt in Mäuse:
   1. Mischen Sie die Zellen in einer Haube in der Tierhaltung vorsichtig, aber gründlich, indem Sie das Röhrchen umdrehen oder eine 1-ml-Spritze verwenden, um sicherzustellen, dass sie gleichmäßig resuspendiert werden. Stellen Sie immer sicher, dass die Zellen resuspendiert sind, bevor Sie die Spritze laden.
   2. Laden Sie eine 1-ml-Luer-Lock-Spritze mit Zellsuspension und stoßen Sie überschüssige Luftblasen aus. Platzieren Sie eine 1/2 Zoll große 30-Gauge-Nadel mit der Abschrägung nach oben auf die Spritze und stoßen Sie Luftblasen aus.
   3. Legen Sie die Maus vorsichtig in einen Nagetierfixierer.
   4. Die seitlichen Schwanzvenen sollten sichtbar und erweitert sein. Wenn nicht, kneifen Sie vorsichtig den Ansatz des Schwanzes zusammen und tauchen Sie den Schwanz in warmes Leitungswasser, um die Venen zu erweitern.
      Anmerkung: Eine Erweiterung der Venen kann auch erreicht werden, indem der Mäusekäfig unter eine Heizlampe und/oder auf ein Heizkissen gelegt wird.
   5. Verwende ein Alkoholtuch, um den Schwanz zu reinigen. Führen Sie die Nadel mit der abgeschrägten Seite nach oben in die Schwanzvene ein und injizieren Sie 100 μl Zellsuspension.
      Anmerkung: Wenn die Nadel richtig in die Vene eingeführt wird, sollte sie leicht nach vorne und hinten gleiten, und es sollte kein Widerstand entstehen, wenn der Kolben gedrückt wird. Erfolgreiche Injektionen sollten auch zu einer "Rötung" führen, bei der die blaue Farbe der Vene nach der Injektion für einige Sekunden weiß wird.
4. Entfernen Sie langsam die Nadel und üben Sie mit einer sterilen Gaze Druck auf die Injektionsstelle aus, um Blutungen zu stoppen.
5. Setzen Sie die Maus wieder in den Käfig ein und überwachen Sie sie 15 Minuten lang, um eine vollständige Wiederherstellung zu gewährleisten. Mäuse sollten 3x wöchentlich auf Anzeichen von Schmerzen oder Beschwerden untersucht werden.
6. Überwachen Sie die Bildung und das Wachstum von Mäusen auf Metastasierung und -wachstum für 3-6 Wochen (abhängig von Zelllinie und Mausstamm) mit einem In-vivo-Bildgebungsgerät für lebende Tiere (siehe Schritte 1.5 und 1.6).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2,5% Trypsin	Gibco	Artikel-Nr.: 15090-046	Trypsin für die Gewebekultur
Alkohol-Tücher			Zur Sterolisierung der Injektionsstelle vor Schwanzveneneinstichen
BALB/C-Mäuse (Weibchen, 6 Wochen)	Takonisch	BALB-F	Für Assays zur metastasierenden Besiedlung und Belastung von Schwanzvenen
Dulbecco&39; s phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Himedia	Artikel-Nr.: TS1006
Edta	VWR	Artikel-Nr.: 97061-406	Wird verwendet, um Trypsin für die Gewebekultur zu verdünnen
FBS 100% US-Herkunft	VWR	Artikel-Nr.: 97068-085	Bestandteil kompletter Wachstumsmedien
L-Glutamin	Gibco	Artikel-Nr.: 25030-081	Bestandteil kompletter Wachstumsmedien
Brustkrebszellen der Maus, 4T1	Karmanos Krebsinstitut	Aslakson, CJ et al., 1992	Metastasierende Brust-Cance-Zelllinie der Maus
Penicillin Streptomycin	Gibco	Nr. 15140-122	Bestandteil kompletter Wachstumsmedien