Methodenartikel

CTC-Immunfluoreszenz-Assay : Eine Technik zur Charakterisierung zirkulierender Tumorzellen

30. April 2023

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quelle: Garcia, J., et al. Halbautomatische PD-L1-Charakterisierung und Zählung von zirkulierenden Tumorzellen von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs durch Immunfluoreszenz.J. Vis. Exp.(2019)

Dieses Video beschreibt den Immunfluoreszenz-Assay für zirkulierende Tumorzellen (CTC), eine Technik zur Charakterisierung der Biomarker auf zirkulierenden Tumorzellen in nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Patientenproben. Dieser Assay könnte verwendet werden, um dynamische Veränderungen des Tumors und der Immunantwort zu überwachen, die das Ansprechen auf Chemotherapie, Bestrahlung und mögliche Immuntherapien widerspiegeln können.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Immunfluoreszenz-Färbung

  1. Zählen Sie auf einem Objektträger mit Kammern und einem hämozytometerartigen Gitter die Anzahl der Zellen pro ml auf. Verdünnen Sie die angereicherte Probe mit 0,2 % Anti-Bindungslösung (Materialtabelle) auf eine Konzentration von 100.000 Zellen/100 μl pro Zytospin.
  2. Die Kontur der Probenkammer wird mit Baumwolle (Materialtabelle) mit 50 μl 0,2%iger Anti-Bindungslösung befeuchtet. Setzen Sie einen Polylysin-Objektträger in die Probenkammer ein und schließen Sie ihn.
  3. Beschichten Sie eine Spitze mit 0,2 %iger Anti-Bindungslösung, indem Sie 3x auf und ab pipettieren. Resuspendieren Sie die angereicherte Probe und überführen Sie die Zelllösung in die Probenkammer. Zentrifugieren Sie mit einer speziellen Zentrifuge (Materialtabelle) bei 400 U/min für 4 min (Beschleunigung niedrig).
  4. Platzieren Sie einen Silizium-Isolator um den Abscheidungsbereich. Lassen Sie den Objektträger unter einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank 2 min trocknen.
  5. Bereiten Sie die Fixierlösung vor, indem Sie 1 ml 16 % Paraformaldehyd (PFA) mit 3 ml sterilem PBS verdünnen. 100 μl Fixierlösung (4 % PFA) pro Probe zugeben und 10 Minuten lang bei RT inkubieren. Entfernen Sie die Fixierlösung und führen Sie drei Wäschen mit 200 μl PBS durch und inkubieren Sie bei RT für jeweils 2 min.
    ACHTUNG: Verwenden Sie PFA unter einer chemischen Sicherheitswerkbank, um ein Einatmen zu verhindern.
  6. Bereiten Sie die Sättigungslösung vor, indem Sie das fötale Rinderserum (FBS) auf 5%, das Fc-Rezeptor (FcR)-blockierende Reagenz auf 5% und das Rinderserumalbumin (BSA) auf 1% in sterilem PBS verdünnen (Table of Materials). 100 μl Sättigungslösung pro Probe zugeben und 30 Minuten bei RT inkubieren. Sättigungslösung entfernen.
  7. 100 μl Antikörperlösung pro Probe (CD45-Antikörper 1/20; PanCK-Antikörper 1/500; PD-L1 Antikörper 1/200; Qsp Sättigungslösung 100 μL) (Materialtabelle). Legen Sie den Polylysin-Objektträger in eine 100 mm x 15 mm große Petrischale. Befeuchten Sie ein saugfähiges Papier mit 2 mL sterilem Wasser und verschließen Sie die Petrischale mit dem Deckel. Über Nacht bei 4 °C aufstellen und vor Licht schützen.
  8. Entfernen Sie den Antikörpermix und führen Sie 3 Waschgänge mit 200 μl PBS durch, wobei Sie jeden Waschgang 2 Minuten lang inkubieren. Lassen Sie die Probe 5 Minuten trocknen und schützen Sie sie vor Licht. 10 μl Einbettlösung (Materialtabelle) in den Bereich der Abscheidung geben und mit einem Mikroskopdeckglas abdecken, ohne eine Blase zu bilden. Versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Pluronisch F-68 10% Gibco Artikel-Nr.: 24040-032Anti-Bindungs-Lösung. Lagerbedingungen: Raumtemperatur
EZ Zytotrichter ThermoFisherA78710003Probenkammer mit Baumwolle. Lagerbedingungen: Raumtemperatur
Shandon Cytopsin4 ZentrifugeThermoFisher A78300003Spezielle Zentrifuge. Lagerbedingungen: Raumtemperatur
Paraformaldehyd 16%ThermoFisher 11490570Lösung für die Fixierung. Lagerbedingungen: +4°C
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung Ultra Pure Grade 1X – 1L1. BasislaborBUF-2040-1X1LLagerbedingungen: Raumtemperatur
FcR-Blockierungsmittel Miltenyi BiotecTel.: 130-059-901Lagerbedingungen: +4°C
Monoklonaler PD-L1-Antikörper (Klon 29E2A3) - PhycoerythrinBioLegende BLE329706 Lagerbedingungen: +4°C
PanCK monoklonaler Antikörper (Klon AE1/AE3) Alexa Fluor 488ThermoFisherTel.: 53-9003-80 Lagerbedingungen: +4°C
CD45 monoklonaler Antikörper (Klon HI30) Alexa Fluor 647BioLegende BLE304020Lagerbedingungen: +4°C
Fluoromount Sigma Nr. F4680Lösung für die Montage. Lagerbedingungen: Raumtemperatur
PetrischaleDutscherArtikel-Nr.: 632180Lagerbedingungen: Raumtemperatur
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)OzymeBE17-512FLagerbedingungen: +4°C
Polylysin-Objektträger ThermoFisherJ2800AMNZLagerbedingungen: Raumtemperatur
Silizium-Isolator Grace Bio-Labore Artikel-Nr.: 664270Lagerbedingungen: Raumtemperatur
Steriles entionisiertes Wasser – 100 mL1. Basislabor CUS-4100-100ml Lagerbedingungen: Raumtemperatur
Fötales Kälberserum (FCS)GibcoNr. 10270-106Lagerbedingungen: +4°C

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

ZytozentrifugationFluoreszenzmikroskopiePD L1 Charakterisierungnicht kleinzelliges LungenkarzinomZellfixierungAntik rpermarkierungPBS WaschungEindeckmedium

Verwandte Artikel