Agarose-Inflation der ganzen Lunge: Eine Methode zur Vorbereitung der Lunge für die ex vivo Live-Bildgebung

Zusammenfassung

Quelle: Van den Bijgaart R.J.E. et al., Ex vivo Live-Bildgebung von Lungenmetastasen und ihrer Mikroumgebung, J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video beschreibt eine Methode zur Vorbereitung von Lungen für die ex vivo Live-Bildgebung, um Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und Stromazellen zu untersuchen, wobei Agarose zum Aufblasen verwendet wird. Im Probenprotokoll wird das Agarose-Aufblasverfahren beschrieben, bevor lebende zelluläre Wechselwirkungen beobachtet werden.

Protokoll

Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Vorbereitung der Lunge für die ex vivo Live-Bildgebung

HINWEIS: Versuchen Sie, so steril und vorsichtig wie möglich zu arbeiten, um unnötige Herausforderungen für die Immunzellen in der Lunge zu vermeiden.

1. Injizieren Sie der Maus intraperitoneal (i.p.) eine letale Überdosis eines Anästhetikums, das nach dem von der IACUC genehmigten Tierprotokoll zulässig ist, z. B. 1 ml 2,5% Avertin. Warten Sie, bis die Maus aufhört zu atmen und völlig unempfindlich auf schädliche Reize reagiert (Kneifen der Hinterpfote).
   HINWEIS: Gebärmutterhalsluxationen und Kohlendioxid-Euthanasie sollten vermieden werden, da dies die Lebensfähigkeit der Lungenzellen beeinträchtigen kann.
2. Immobilisieren Sie die Maus auf einem Sezierbrett und sterilisieren Sie die Maus mit 70% Ethanol.
3. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um zuerst einen quer verlaufenden epigastrischen Schnitt durch die Haut zu machen, gefolgt von einem ähnlichen Schnitt durch das Bauchfell. Halten Sie das Präparierbrett in einer vertikalen Position und schneiden Sie die absteigende Aorta so ab, dass sich das Blut im Bauch und nicht in der Brusthöhle sammelt.
4. Schneiden Sie eine kleine Öffnung in die Membran, um das Vakuum abzulassen. Schneiden Sie entlang der 10. und 12. Rippe, um das Zwerchfell herauszuschneiden und einen visuellen Zugang zur Lunge zu erhalten.
5. Schneide die Haut mit einer chirurgischen Schere bis zur Luftröhre über dem Brustkorb auf, aber lasse den Brustkorb intakt. Trenne die Haut vom Brustkorb. Legen Sie die Luftröhre frei, indem Sie das umgebende Bindegewebe entfernen, wobei Sie darauf achten müssen, die Luftröhre selbst nicht zu beschädigen (Abbildung 1A).
6. Schneiden Sie eine kleine Öffnung mit einem Durchmesser von etwa 1 mm in die freiliegende Luftröhre parallel zu den Knorpelringen, so nah wie möglich am Kehlkopf (Abbildung 1B). Achte darauf, dass du die Luftröhre nicht komplett durchschneidest.
7. Nehmen Sie eine 20 G Nadel und führen Sie die Nadel ohne Gegenkraft vorsichtig 4-5 mm in die Luftröhre ein (Abbildung 1D). Das Ende der Nadel sollte durch die Luftröhre sichtbar sein (Abbildung 1C). Verwenden Sie eine Pinzette, um die Nadel in der Luftröhre zu stabilisieren. Alternativ kann eine Naht um die Luftröhre gebunden werden, um die Nadel an Ort und Stelle zu halten.
   HINWEIS: Durch zu tiefes Einführen kann die Carina traumatisiert werden oder nur eine Seite der Lunge aufgebläht werden.
8. Eine Spritze wird mit 400 μl 37 °C 2 % Agarose bei niedriger Schmelztemperatur gefüllt (direkt aus einem Bad mit konstanter Temperatur entnommen). Stellen Sie sicher, dass das Präparierbrett aufrecht steht und träufeln Sie die warme Agarose langsam durch die Nadel in die Lunge, verwenden Sie ~400 μl, um die Lunge aufzublasen.
   HINWEIS: Beobachten Sie, wie sich die Lunge im Brustkorb aufbläht. Pumpen Sie die Lunge nicht zu stark auf, da sie sonst reißt.
9. Sobald die Lunge aufgeblasen ist und ~2/3 des Brustkorbs gefüllt ist, nehmen Sie die Spritze ab und halten Sie die Nadel in der Luftröhre, um zu verhindern, dass Agarose ausläuft.
10. Gießen Sie ca. 50 ml 20 °C PBS über die aufgeblasene Lunge, damit die Agarose in der Lunge fest werden und sich verfestigen kann. Entfernen Sie langsam die Nadel und verschließen Sie die Luftröhre mit einer Pinzette, um zu verhindern, dass unverfestigte Agarose austritt.
11. Legen Sie die Lunge frei, indem Sie eine Sternotomie durchführen und anschließend die Lunge herausschneiden. Halten Sie sich bei der Entfernung der Lunge an der Luftröhre fest, während Sie die Luftröhre vollständig durchschneiden. Ziehen Sie die Luftröhre vorsichtig nach oben, schneiden Sie das Bindegewebe und die Speiseröhre ab und ziehen Sie die Lunge aus der Brusthöhle, bis die Lunge von der Maus getrennt ist (Abbildung 1E).
12. Tauchen Sie die Lunge in warmes RPMI-1640, um überschüssiges Blut abzuwaschen, und trennen Sie die Lappen vorsichtig, indem Sie mit Schere und Pinzette den Hauptstammbronchus der Lappen am Hilum durchtrennen (Abbildung 1F).
13. Platzieren Sie die Lappen mit der flachen Oberfläche nach unten, um die Bildgebungsfläche zu maximieren, in einer Vertiefung einer 24-Well-Speicherfolie (Abbildung 1G). Geben Sie 100 μl 37 ΰC RPMI-1640 auf die Keulen. Platzieren Sie mehrere 15 mm kreisförmige Objektträger für das Mikroskop auf den Keulen, um ein Schweben zu verhindern.
14. Gießen Sie warmes PBS in die umliegenden Vertiefungen, um zu verhindern, dass das RPMI-1640-Medium verdunstet. Die 24-Well-Platte wird in die äquilibrierte Klimakammer eingesetzt und die Lungenlappen mit Luft und 5 % CO₂ auf 37 °C gehalten. Setzen Sie die Klimakammer auf den Tisch des Konfokalmikroskops ein.
    HINWEIS: Andere Gasgemische (z. B. 5 % O₂, 5 % CO₂ in N₂ zur Untersuchung des Zellverhaltens unter Bedingungen von Hypoxie/niedrigerem Sauerstoffgehalt) könnten ebenfalls in Betracht gezogen werden.

Ergebnisse

Abbildung 1. Protokoll zur Vorbereitung der Lunge für die Live-Bildgebung.(A) Freilegung der Luftröhre nach Präparation der Maus. (B) Kleiner Schnitt in der freiliegenden Luftröhre parallel zu den Knorpelringen. (C) 20 G Nadel 4-5 mm in die Luftröhre einführen. (D) Instillieren von 400 μl 2 % Agarose bei ni...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anästhetikum	Na	Na	Von der IACUC zugelassene Anästhesie, die für die Anästhesie und/oder Sterbehilfe verwendet wird
PBS, USP steril	Amresco INC	K813-500ML	Ultrareine Sorte für die intravenöse Injektion
1X PBS	UCSF-Zellkulturanlage	Na
Plattform aus Styropor	Na	Na	Wird als Sezierbrett verwendet
Feine Schere scharf	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 14060-11
20 G x 1 Nadel, kurze Fase	Bd	305178
Zange	Roboz Chirurgischer Laden	RS-5135
1 mL Spritze ohne Nadel	Bd	309659
Agarose bei niedriger Schmelztemperatur	Lonza	50111	Um 10 ml Lösung herzustellen, wiegen Sie 0,2 g Agarose, fügen Sie 1 x PBS zu 10 ml hinzu und erhitzen Sie sie, um sich aufzulösen. Agarose erstarrt bei Raumtemperatur, also in einem 37 °C warmen Wasserbad aufbewahren, bis sie zum Aufblasen verwendet wird.
RPMI-1640 Medium ohne Phenolrot	Lebenstechnologien	Tel.: 11835-030
24-Well-Speicherfolie	E&K wissenschaftlich	EK-42892
Glasabdeckfolien, 15 mm	Fisher Scientific	Tel.: 22-031-144
Digitaler CO2- und Temperaturregler	Okolab	DGTCO2BX	http://www.oko-lab.com
Klimakammer	Okolab	Na	http://www.oko-lab.com
Cell Observer Konfokalmikroskop mit rotierender Scheibe	Zeiss	Na
Luft	Ucsf	Na
Sauerstoff	Ucsf	Na
Kohlendioxid	Ucsf	Na