1. Passieren und Kultivieren von TUM622-Zellen in 2D-Kulturen
- Warmes 3D-Kulturmedium und Zelldissoziationsreagenzien (siehe Materialtabelle) für TUM622-Zellen bei 37 °C.
- Passage TUM622-Zellen mit 80% Konfluenz in 2D-Kolben. In der Regel geschieht dies 1 Woche nach dem Passieren.
- Altes Medium aus einem T75-Kolben entsorgen und einmal mit 6 ml HEPES-Puffer waschen. Vermeiden Sie es, direkt auf die Zellen zu pipettieren.
- Aspirieren Sie den HEPES-Puffer. Fügen Sie 4 ml Trypsin/EDTA (0,25 mg/ml, siehe Materialtabelle) für eine schnelle Spülung hinzu und verwerfen Sie das Trypsin/EDTA.
- Fügen Sie 2 mL Trypsin/EDTA hinzu und inkubieren Sie 5 Minuten lang bei 37 °C. Nehmen Sie die Kolben aus dem Inkubator und klopfen Sie auf die Kolben, um die Zellen zu lösen, ohne Luftblasen zu bilden, und stellen Sie die Kolben für weitere 5 Minuten in den Inkubator zurück.
Anmerkung: Eine längere Exposition gegenüber Trypsin schädigt die Zellen irreversibel und verändert ihren Phänotyp, daher wird empfohlen, die Zeit, in der die Zellen Trypsin ausgesetzt sind, zu begrenzen.
- Bestätigen Sie, dass sich die Zellen unter einem Lichtmikroskop abgelöst und dissoziiert haben (4x oder 10x). Fügen Sie 4 ml Neutralisationspuffer (TNS-Puffer) hinzu (siehe Informationen zu den Subkulturreagenzien in der Materialtabelle), gefolgt von 10 ml 3D-Kulturmedium (siehe Materialtabelle).
- Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Zellen mit einer 10-ml-Pipette weiter zu dissoziieren. Die Suspension wird durch ein 40-μm-Zellsieb in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführt.
- Zählen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
- 0,8 x 106 Zellen/T75-Kolben in 20 mL 3D-Kulturmedium entkernen (siehe Materialtabelle).
- Füttern Sie die Zellen jeden zweiten Tag, indem Sie die Hälfte des verbrauchten Mediums durch frisches Medium ersetzen.
2. Beschichtung von TUM622-Zellen in der extrazellulären Matrix für die 3D-Kultivierung
- Tauen Sie am Tag vor dem Experiment Fläschchen mit Basalmembranmatrix über Nacht in einem 4 °C Kühlschrank auf. Kühlen Sie Kunststoffpipetten (2 mL) und Spitzen über Nacht bei -20 °C ab.
Anmerkung: Nicht alle Chargen von Basalmembran-Matrizen haben die gleiche Kapazität, um das 3D-Wachstum von TUM622-Zellen zu unterstützen. Daher ist es notwendig, mehrere Chargen von Basalmembranmatrix zu erwerben und zu testen, um diejenigen zu identifizieren, die eine robuste Acini-Bildung unterstützen. In der Regel erfordert dies eine höhere Proteinkonzentration (16-18 mg/ml) in der Matrix.
- Am Tag des Experiments 3D-Kulturmedium, HEPES-Puffer, Trypsin/EDTA und Trypsin-Neutralisationspuffer (TNS) in einem 37 °C warmen Wasserbad erwärmen. Nehmen Sie unmittelbar vor dem Aufstellen der Kultur die aufgetaute Basalmembranmatrix aus dem Kühlschrank und stellen Sie das Fläschchen auf Eis.
- Kühlen Sie die Gewebekulturplatten auf einer Metallplattform ab, die auf Eis steht. Stellen Sie die Zentrifugenröhrchen auf ein Kühlgestell aus Metall auf Eis.
- Berechnen Sie anhand von TUM622-Zellen aus Schritt 1.7 die gewünschte Anzahl von Zellen, die für die Beschichtung benötigt werden. In der Regel werden 15.000 bis 30.0000 Zellen pro Well einer 24-Well-Platte benötigt. Eine niedrigere Dichte eignet sich besser für die Bildgebung und Quantifizierung, während eine höhere Dichte bei der Entnahme von Zellen für die RNA-Extraktion oder Western Blot bevorzugt wird.
- Die Zellsuspension in ein gekühltes Zentrifugenröhrchen überführen (jedes Röhrchen enthält Zellen für die dreifache Beschichtung) und bei 300 x g in einer hängenden Eimerzentrifuge bei 4 °C für 5 min herunterschleudern.
- Der Überstand wird vorsichtig mit einer Aspirationspipette aspiriert, die an einer ungefilterten Spitze (20 μl) befestigt ist, wobei ca. 100 μl des Mediums im Röhrchen verbleiben (Markierungen auf dem Röhrchen dienen als Anhaltspunkt).
- Klopfen Sie vorsichtig auf die Seite des Rohrs, um das Pellet zu lösen und zu dissoziieren, bevor Sie es wieder in das Kühlgestell legen.
- Mischen Sie die Matrix vorsichtig mit den vorgekühlten 2-ml-Pipetten, indem Sie einige Male auf und ab pipettieren, während Sie das Fläschchen in Kontakt mit dem Eis halten. Pipettieren Sie mit einer gleichmäßigen und moderaten Geschwindigkeit, so dass bei diesem Vorgang keine Blasen in die Matrize eingebracht werden.
- Übertragen Sie das entsprechende Volumen der Matrix in jedes Zentrifugenröhrchen. Für die Beschichtung von Triplikaten in einer 24-Well-Platte geben Sie 1,1 ml Basalmembranmatrix in jedes Röhrchen.
- Pipettieren Sie die Matrix in jedem Röhrchen mit vorgekühlten Spitzen etwa 10 Mal auf und ab, um eine gleichmäßige Zellsuspension herzustellen.
- Übertragen Sie 310 μl Zell-/Matrixsuspension in jede Vertiefung einer vorgekühlten 24-Well-Platte. Die Pipette wird in einem Winkel von 90° zur Plattenoberfläche platziert und die Suspension in die Mitte der Vertiefung gegeben. Die Suspension sollte sich ausbreiten und die gesamte Vertiefung abdecken, ohne dass die Platte gekippt werden muss.
- Um die nachgelagerte Immunfluoreszenzanalyse zu erleichtern, plattieren Sie die Zell-/Matrixsuspension parallel in 2-Well-Kammer-Objektträger. Übertragen Sie 100 μl Zell-/Matrixsuspension in die Mitte einer Vertiefung des 2-Well-Kammerobjektträgers (siehe Materialtabelle). Dadurch kann die Matrix eine kuppelartige Struktur mit viel kleinerem Volumen bilden.
- Setzen Sie die Platte und den Schlitten der Kammer zurück in einen Gewebekultur-Inkubator und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang, damit sich die Matrize verfestigen kann. Untersuchen Sie die Platte/den Objektträger unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass die einzelnen Zellen gleichmäßig in der Matrix verteilt sind (4x oder 10x).
- Geben Sie 1 ml vorgewärmtes 3D-Kulturmedium in jede Vertiefung und 1,5 ml 3D-Kulturmedium in jede Vertiefung des Kammerobjektträgers und geben Sie sie dann wieder in den Inkubator.
