1.Passieren und Kultivieren von TUM622-Zellen und CAFs in 2D-Kulturen
- Passieren und Kultivieren von TUM622-Zellen
- Warmes 3D-Kulturmedium und Zelldissoziationsreagenzien (siehe Materialtabelle) für TUM622-Zellen bei 37 °C.
- Passage TUM622-Zellen mit 80% Konfluenz in 2D-Kolben. In der Regel geschieht dies 1 Woche nach dem Passieren.
- Altes Medium aus einem T75-Kolben entsorgen und einmal mit 6 ml HEPES-Puffer waschen. Vermeiden Sie es, direkt auf die Zellen zu pipettieren.
- Aspirieren Sie den HEPES-Puffer. Fügen Sie 4 ml Trypsin/EDTA (0,25 mg/ml, siehe Materialtabelle) für eine schnelle Spülung hinzu und verwerfen Sie das Trypsin/EDTA.
- Fügen Sie 2 mL Trypsin/EDTA hinzu und inkubieren Sie 5 Minuten lang bei 37 °C. Nehmen Sie die Kolben aus dem Inkubator und klopfen Sie auf die Kolben, um die Zellen zu lösen, ohne Luftblasen zu bilden, und stellen Sie die Kolben für weitere 5 Minuten in den Inkubator zurück.
Anmerkung: Eine längere Exposition gegenüber Trypsin schädigt die Zellen irreversibel und verändert ihren Phänotyp, daher wird empfohlen, die Zeit, in der die Zellen Trypsin ausgesetzt sind, zu begrenzen.
- Bestätigen Sie, dass sich die Zellen unter einem Lichtmikroskop abgelöst und dissoziiert haben (4x oder 10x). Fügen Sie 4 ml Neutralisationspuffer (TNS-Puffer) hinzu (siehe Informationen zu den Subkulturreagenzien in der Materialtabelle), gefolgt von 10 ml 3D-Kulturmedium (siehe Materialtabelle).
- Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Zellen mit einer 10-ml-Pipette weiter zu dissoziieren. Die Suspension wird durch ein 40-μm-Zellsieb in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführt.
- Zählen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
- 0,8 x 106 Zellen/T75-Kolben in 20 mL 3D-Kulturmedium entkernen (siehe Materialtabelle).
- Füttern Sie die Zellen jeden zweiten Tag, indem Sie die Hälfte des verbrauchten Mediums durch frisches Medium ersetzen.
- Passen und Kultivieren von CAFs
- Passage CAFs, wenn Zellen Konfluenz erreichen. In der Regel geschieht dies nach 5 Tagen Kultivierung aus einer 1:2-Aufteilung.
- Bereiten Sie CAF-Medium mit RPMI-Basalmedium mit 20 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 1 % L-Glutamin und 1 % Penicillin/Streptomycin vor. Das Medium auf 37 °C erwärmen.
- In einem T75-Kolben werden die CAFs einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült, dann 2 ml Trypsin/EDTA hinzugefügt und 5 Minuten lang bei 37 °C inkubiert.
- Unter einem Lichtmikroskop beobachten, um sicherzustellen, dass die Zellen im Kolben dissoziiert sind (4x oder 10x). Wenn nicht, verlängern Sie die Inkubation um weitere 2-3 Minuten.
- Sobald sich die Zellen abgelöst und dissoziiert haben, fügen Sie 10 ml 3D-Kulturmedium hinzu, um das Trypsin/EDTA zu neutralisieren, und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um die CAFs weiter zu dissoziieren.
- Die Zellsuspension in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführen und bei 300 x g 5 min bei Raumtemperatur abschleudern.
- Der Überstand wird verworfen und das Pellet in einem geeigneten Volumen des 3D-Kulturmediums (siehe Materialtabelle) wieder suspendiert und in zwei neue T75-Kolben überführt.
2. Beschichtung von TUM622-Zellen in der extrazellulären Matrix für die 3D-Kultivierung
- Tauen Sie am Tag vor dem Experiment Fläschchen mit Basalmembranmatrix über Nacht in einem 4 °C Kühlschrank auf. Kühlen Sie Kunststoffpipetten (2 mL) und Spitzen über Nacht bei -20 °C ab.
Anmerkung: Nicht alle Chargen von Basalmembran-Matrizen haben die gleiche Kapazität, um das 3D-Wachstum von TUM622-Zellen zu unterstützen. Daher ist es notwendig, mehrere Chargen von Basalmembranmatrix zu erwerben und zu testen, um diejenigen zu identifizieren, die eine robuste Acini-Bildung unterstützen. In der Regel erfordert dies eine höhere Proteinkonzentration (16-18 mg/ml) in der Matrix.
- Am Tag des Experiments 3D-Kulturmedium, HEPES-Puffer, Trypsin/EDTA und Trypsin-Neutralisationspuffer (TNS) in einem 37 °C warmen Wasserbad erwärmen. Nehmen Sie unmittelbar vor dem Aufstellen der Kultur die aufgetaute Basalmembranmatrix aus dem Kühlschrank und stellen Sie das Fläschchen auf Eis.
- Kühlen Sie die Gewebekulturplatten auf einer Metallplattform ab, die auf Eis steht. Stellen Sie die Zentrifugenröhrchen auf ein Kühlgestell aus Metall auf Eis.
- Berechnen Sie unter Verwendung von TUM622-Zellen aus Schritt 1.1.7 die gewünschte Anzahl von Zellen, die für die Beschichtung benötigt werden. In der Regel werden 15.000 bis 30.0000 Zellen pro Well einer 24-Well-Platte benötigt. Eine niedrigere Dichte eignet sich besser für die Bildgebung und Quantifizierung, während eine höhere Dichte bei der Entnahme von Zellen für die RNA-Extraktion oder Western Blot bevorzugt wird.
- Die Zellsuspension in ein gekühltes Zentrifugenröhrchen überführen (jedes Röhrchen enthält Zellen für die dreifache Beschichtung) und bei 300 x g in einer hängenden Eimerzentrifuge bei 4 °C für 5 min herunterschleudern.
- Der Überstand wird vorsichtig mit einer Aspirationspipette aspiriert, die an einer ungefilterten Spitze (20 μl) befestigt ist, wobei ca. 100 μl des Mediums im Röhrchen verbleiben (Markierungen auf dem Röhrchen dienen als Anhaltspunkt).
- Klopfen Sie vorsichtig auf die Seite des Rohrs, um das Pellet zu lösen und zu dissoziieren, bevor Sie es wieder in das Kühlgestell legen.
- Mischen Sie die Matrix vorsichtig mit den vorgekühlten 2-ml-Pipetten, indem Sie einige Male auf und ab pipettieren, während Sie das Fläschchen in Kontakt mit dem Eis halten. Pipettieren Sie mit einer gleichmäßigen und moderaten Geschwindigkeit, so dass bei diesem Vorgang keine Blasen in die Matrize eingebracht werden.
- Übertragen Sie das entsprechende Volumen der Matrix in jedes Zentrifugenröhrchen. Für die Beschichtung von Triplikaten in einer 24-Well-Platte geben Sie 1,1 ml Basalmembranmatrix in jedes Röhrchen.
- Pipettieren Sie die Matrix in jedem Röhrchen mit vorgekühlten Spitzen etwa 10 Mal auf und ab, um eine gleichmäßige Zellsuspension herzustellen.
- Übertragen Sie 310 μl Zell-/Matrixsuspension in jede Vertiefung einer vorgekühlten 24-Well-Platte. Die Pipette wird in einem Winkel von 90° zur Plattenoberfläche platziert und die Suspension in die Mitte der Vertiefung gegeben. Die Suspension sollte sich ausbreiten und die gesamte Vertiefung abdecken, ohne dass die Platte gekippt werden muss.
- Um die nachgelagerte Immunfluoreszenzanalyse zu erleichtern, plattieren Sie die Zell-/Matrixsuspension parallel in 2-Well-Kammer-Objektträger. Übertragen Sie 100 μl Zell-/Matrixsuspension in die Mitte einer Vertiefung des 2-Well-Kammerobjektträgers (siehe Materialtabelle). Dadurch kann die Matrix eine kuppelartige Struktur mit viel kleinerem Volumen bilden.
- Setzen Sie die Platte und den Schlitten der Kammer zurück in einen Gewebekultur-Inkubator und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang, damit sich die Matrize verfestigen kann. Untersuchen Sie die Platte/den Objektträger unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass die einzelnen Zellen gleichmäßig in der Matrix verteilt sind (4x oder 10x).
- Geben Sie 1 ml vorgewärmtes 3D-Kulturmedium in jede Vertiefung und 1,5 ml 3D-Kulturmedium in jede Vertiefung des Kammerobjektträgers und geben Sie sie dann wieder in den Inkubator.
3. 3D Kokulturierung von TUM622-Zellen und CAFs in der extrazellulären Matrix
- Bereiten Sie Zellsuspensionen von TUM622 und CAFs gemäß Abschnitt 2 vor.
- Zählen Sie die CAF-Zelldichte, indem Sie 10 μl Zellsuspension nehmen und mit 10 μl Trypanblau mischen.
- Geben Sie 10 μl der Mischung in jede der beiden Kammern eines Hämazytometers, um die Zelldichte zu zählen und zu berechnen.
Anmerkung: CAFs haben unregelmäßige Formen und können auf einem automatischen Zellzähler möglicherweise nicht genau gezählt werden.
- Co-Embedding von TUM622-Zellen und CAFs in eine Basalmembran-Matrix
- Berechnen Sie basierend auf den Informationen zur Zelldichte die gewünschte Anzahl von Zellen, die für die Beschichtung verwendet werden. CAFs werden im Verhältnis 2:1 von TUM622-Zellen ausgesät. Zum Beispiel werden für 30.000 ausgesäte TUM622-Zellen 60.000 CAFs co-eingebettet.
- Übertragen Sie das entsprechende Volumen von TUM622 sowie der CAF-Zellsuspension in dasselbe Zentrifugenröhrchen und befolgen Sie die Schritte 2.5-2.11 zum Plattieren in 24-Well-Platten. Für die Immunfluoreszenz 60 μl TUM622/CAFs-Mischung wie in Schritt 2.12 beschrieben auf Kammer-Objektträger übertragen.
- Kokulturierung von TUM622 mit überlagerten CAFs in Basalmembranmatrix (siehe Materialtabelle)
- Richten Sie die TUM622-Monokultur gemäß den Schritten 2.5-2.13 ein.
- Die doppelte Anzahl der CAF-Suspension (im Vergleich zur Anzahl der ausgesäten TUM622-Zellen) in ein Zentrifugenröhrchen überführen und bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur abschleudern.
- Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die CAFs in 1 ml 3D-Kulturmedium.
- Übertragen Sie die 1 ml CAF-Suspension in die Vertiefung mit den eingebetteten TUM622-Zellen.
