RNA-Extraktions-Assay: Eine Methode zur Extraktion von RNA aus miRNA-transfizierten Lungenkrebszellen

Zusammenfassung

Quelle: Hossian, A. K. M. N. et al., Analyse von kombinatorischen miRNA-Behandlungen zur Regulierung des Zellzyklus und der Angiogenese. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video beschreibt das RNA-Extraktionsprotokoll aus miRNA-transfizierten Lungenkrebszellen. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um eine kombinatorische miRNA-Behandlungsaktivität beim Stoppen des Zellzyklus und der Angiogenese zu identifizieren.

Protokoll

>1. miR-143 und miR-506 Transfektion

VORSICHT: Verwenden Sie Latexhandschuhe, eine Schutzbrille und einen Laborkittel, während Sie die beschriebenen Experimente durchführen. Verwenden Sie die Biosicherheitswerkbank bei Bedarf mit eingeschaltetem Schranklüfter, ohne die Atemwege zu blockieren oder den laminaren Luftstrom zu stören. Stellen Sie das Schutzglas immer auf die entsprechende Höhe ein, wie vom Hersteller beschrieben.

1. NSCLC A549-Zellen in einer T25 cm 2-Kolben-/6/96-Well-Platte in DMEM/F12K-Medien, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin (Kulturmedien), in einer Gewebekulturhaube aussäen und über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO₂ in einem Gewebekultur-Inkubator inkubieren.
2. Suspendieren Sie miR-143- und/oder miR-506-Nachahmer oder mischen Sie siRNA mit einem Transfektionsmittel (2,4 μg miR wurden mit 14 μl Transfektionsmittel gemischt; siehe Materialtabelle) in 500 μl Transfektionsmedium und 1,5 ml Serum und antibiotikafreiem DMEM/F12K-Medium bei einer endgültigen miRNA-Konzentration von 100 nM. Die miRNA-Menge kann eine Optimierung auf verschiedenen Zellen und Konzentrationen erfordern. Geeignete Ansätze umfassen die Transfektion von Zellen mit steigenden Konzentrationen von miRNA (d.h. 50-200 nM) und die Bewertung der Expressionsherunterregulierung der interessierenden Gene.
3. Nehmen Sie das Nährmedium aus dem Kolben/der Platte und waschen Sie es einmal mit 1x PBS.
4. miRNA/Scramble-Transfiktionsmittel-Komplexe zugeben und bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 6 h inkubieren (die Kolbengröße definiert das hinzugefügte Inkubationsvolumen).
5. Ersetzen Sie das Medium durch 4 ml Kulturmedium und inkubieren Sie die Zellen für 24 h und/oder 48 h.
6. Entnommene transfizierte Zellen durch Trypsinisierung, indem 1 ml Trypsin-EDTA in jeden T25 cm^2-Kolben gegeben wird, 5-10 Minuten bei 37 °C inkubiert und 3 ml Nährmedium hinzugefügt werden, um die Zellen zu ernten. Der Inhalt jedes Kolbens wird in ein separates, mit 15 ml Fassungsvermögen gekennzeichnetes Röhrchen gegeben. Arbeiten Sie in einer Gewebekulturhaube.
Bei
7. 751 x g 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.
   Anmerkung: Bei der Entfernung des Überstands ist Vorsicht geboten, da das Bewegen des Röhrchens zum Verlust von Zellen führen kann.
8. Fügen Sie 2 mL 1x PBS hinzu und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 751 x g.
9. Wiederholen Sie die Schritte 7 und 8 einmal, um alle Spuren von Medien und Überständen zu entfernen.
   Anmerkung: In diesem Stadium können die Probenröhrchen bei -80 °C gelagert oder sofort verwendet werden.

>2. RNA-Extraktion

1. Reinigen Sie den Arbeitsbereich durch Besprühen mit 70%igem Isopropylalkohol und RNAse-Dekontaminationslösung.
2. Die RNA-Extraktion sollte mit einem geeigneten RNA-Kit durchgeführt werden (siehe Materialtabelle).
3. Nehmen Sie die Röhrchen bei -80 °C heraus und lassen Sie sie auftauen. Geben Sie 300 μl Lysepuffer hinzu und pipettieren Sie auf und ab, um die Zellmembran aufzubrechen.
4. Fügen Sie das gleiche Volumen von 100 % hochreinem Ethanol hinzu.
5. Gut mischen und in die Trennsäule geben.
6. Zwischen 11 und 16 x g für 30 s zentrifugieren und den Durchfluss entfernen.
7. Fügen Sie 400 μl Waschpuffer hinzu und zentrifugieren Sie, um den Puffer zu entfernen.
8. In jede Probe werden 5 μl DNAse I mit 75 μl DNA-Aufschlusspuffer gegeben und 15 Minuten lang inkubiert.
9. Waschen Sie die Probe mit 400 μl RNA-Vorbereitungspuffer.
10. 2x mit RNA-Waschpuffer waschen.
11. Geben Sie nukleasefreies Wasser in die Säule, zentrifugieren Sie und sammeln Sie dann die RNA.
12. Messen Sie die Gesamt-RNA-Konzentration mit einem UV-Spektralphotometer.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
A549 Nicht-kleinzellige Lungenkrebszellen	ATCC	ATCC CCL-185
Ambion Silencer Negativkontrolle Nr. 1 siRNA	Ambion	AM4611
has-miR-143-3p miRNA-Nachahmung	Abm	MCH01315
has-miR-506-3p miRNA-Nachahmung	Abm	MCH02824
Fötales Rinderserum (FBS)	Fisher Scientific	10438026
HyClone Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Fisher Scientific	SH30256FS
DMEM 4,5 g/L Glukose, ohne Natriumpyruvat, ohne L-Glutamin	VWR	VWRL0100-0500
Invitrogen UltraPure DNase/ RNase-freies destilliertes Wasser	Invitrogen	Tel.: 10-977-015
Quick-RNA-Kits	Zymo-Forschung	Nr. R1055
Ethanol, absolut (200 proof), molekularbiologische Qualität,	Fisher BioReagenzien	BP2818500
-80 °C Gefrierschrank	VWR	VWR40086A
Nanotropfen	Thermo Scientific	NanoDrop one C
96-Well-Platte	CELLTREAT Wissenschaftlich	Tel.: 50-607-511
Penicillin-Streptomycin 10/10	Antlanta Biologicals	Nr. B21210
CO2-Inkubator	Thermo Scientific	HERAcell 150i
dNaSe	Zymo-Forschung	Nr. E1010
F-12K Nährstoffmischung (Kaighn's Mod.) mit L-Glutamin, Corning	Corning	Artikel-Nr.: 45000-354
Fötales Rinderserum - Premium	Antlanta Biologicals	Nr. S11150
Temperaturgesteuerte Zentrifuge Matchine	Thermo Scientific	ST16R
Temperaturgesteuerte Mikrozentrifuge Matchine	Eppendrof	5415R