1. miR-143 und miR-506 Transfektion
VORSICHT: Verwenden Sie Latexhandschuhe, eine Schutzbrille und einen Laborkittel, während Sie die beschriebenen Experimente durchführen. Verwenden Sie die Biosicherheitswerkbank bei Bedarf mit eingeschaltetem Schranklüfter, ohne die Atemwege zu blockieren oder den laminaren Luftstrom zu stören. Stellen Sie das Schutzglas immer auf die entsprechende Höhe ein, wie vom Hersteller beschrieben.
- NSCLC A549-Zellen in einer T25 cm 2-Kolben-/6/96-Well-Platte in DMEM/F12K-Medien, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin (Kulturmedien), in einer Gewebekulturhaube aussäen und über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO2 in einem Gewebekultur-Inkubator inkubieren.
- Suspendieren Sie miR-143- und/oder miR-506-Nachahmer oder mischen Sie siRNA mit einem Transfektionsmittel (2,4 μg miR wurden mit 14 μl Transfektionsmittel gemischt; siehe Materialtabelle) in 500 μl Transfektionsmedium und 1,5 ml Serum und antibiotikafreiem DMEM/F12K-Medium bei einer endgültigen miRNA-Konzentration von 100 nM. Die miRNA-Menge kann eine Optimierung auf verschiedenen Zellen und Konzentrationen erfordern. Geeignete Ansätze umfassen die Transfektion von Zellen mit steigenden Konzentrationen von miRNA (d.h. 50-200 nM) und die Bewertung der Expressionsherunterregulierung der interessierenden Gene.
- Nehmen Sie das Nährmedium aus dem Kolben/der Platte und waschen Sie es einmal mit 1x PBS.
- miRNA/Scramble-Transfiktionsmittel-Komplexe zugeben und bei 37 °C mit 5 % CO2 für 6 h inkubieren (die Kolbengröße definiert das hinzugefügte Inkubationsvolumen).
- Ersetzen Sie das Medium durch 4 ml Kulturmedium und inkubieren Sie die Zellen für 24 h und/oder 48 h.
- Entnommene transfizierte Zellen durch Trypsinisierung, indem 1 ml Trypsin-EDTA in jeden T25 cm2-Kolben gegeben wird, 5-10 Minuten bei 37 °C inkubiert und 3 ml Nährmedium hinzugefügt werden, um die Zellen zu ernten. Der Inhalt jedes Kolbens wird in ein separates, mit 15 ml Fassungsvermögen gekennzeichnetes Röhrchen gegeben. Arbeiten Sie in einer Gewebekulturhaube.
Bei - 751 x g 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.
Anmerkung: Bei der Entfernung des Überstands ist Vorsicht geboten, da das Bewegen des Röhrchens zum Verlust von Zellen führen kann.
- Fügen Sie 2 mL 1x PBS hinzu und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 751 x g.
- Wiederholen Sie die Schritte 7 und 8 einmal, um alle Spuren von Medien und Überständen zu entfernen.
HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Probenröhrchen bei -80 °C gelagert oder sofort verwendet werden.
2. Zellzyklus-Analyse
- 5 x 105 Zellen für jede Probe in einen T25 cm2-Kolben ausstechen und eine Transfektion gemäß dem in Abschnitt 1, Schritte 1-5 beschriebenen Protokoll durchführen.
- Nach 24 h und 48 h, dann die Zellen durch Trypsinisierung ernten.
- Übertragen Sie die Zellsuspensionen in sterile 15-ml-Röhrchen und markieren Sie sie ordnungsgemäß.
- Proben bei 751 x g für 5 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
- 2 mL eiskaltes 1x PBS, Vortex hinzufügen und 5 Minuten lang bei 751 x g zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.
- Wiederholen Sie den Waschschritt mit 1x PBS, um Medienreste zu entfernen.
- Resuspendieren und brechen Sie das Pellet, indem Sie 200 μL eiskaltes 1x PBS durch Pipettieren hinzufügen.
- Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 2 ml 70% eiskaltes Ethanol tropfenweise in das Röhrchen geben, während Sie es vorsichtig vortexen.
Die - Röhrchen 30 min bei RT inkubieren und die Röhrchen 1 h lang bei 4 °C erhitzen.
- Röhrchen bei 4 °C entnehmen und bei 751 x g 5 min zentrifugieren.
- 2 mL eiskaltes 1x PBS, Vortex hinzufügen und 5 Minuten lang bei 751 x g zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.
- Fügen Sie 500 μl 1x PBS mit Propidiumiodid (50 μg/ml) und Ribonuklease A (200 μg/ml) hinzu.
- Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei RT und schützen Sie die Proben vor Licht.
- Erfassen Sie Daten auf dem Durchflusszytometer. Verwenden Sie die Vorwärts- vs. Seitenstreuung (FSC vs. SSC), um die Hauptpopulation von Zellen auszuwählen, wobei Ablagerungen in der unteren linken Ecke des Dichtediagramms FSC vs. SSC und Zellcluster von oben nach rechts oben bis oben rechts im Dichtediagramm FSC vs. SSC ausgeschlossen sind.
- Analysieren Sie Daten zur Identifizierung von Zellpopulationen pro Zellzyklusstadium mit geeigneter Software.