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1. miR-143 und miR-506 Transfektion
VORSICHT: Verwenden Sie Latexhandschuhe, eine Schutzbrille und einen Laborkittel, während Sie die beschriebenen Experimente durchführen. Verwenden Sie die Biosicherheitswerkbank bei Bedarf mit eingeschaltetem Schranklüfter, ohne die Atemwege zu blockieren oder den laminaren Luftstrom zu stören. Stellen Sie das Schutzglas immer auf die entsprechende Höhe ein, wie vom Hersteller beschrieben.
- NSCLC A549-Zellen in einer T25 cm 2-Kolben-/6/96-Well-Platte in DMEM/F12K-Medien, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin (Kulturmedien), in einer Gewebekulturhaube aussäen und über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO2 in einem Gewebekultur-Inkubator inkubieren.
- Suspendieren Sie miR-143- und/oder miR-506-Nachahmer oder mischen Sie siRNA mit einem Transfektionsmittel (2,4 μg miR wurden mit 14 μl Transfektionsmittel gemischt; siehe Materialtabelle) in 500 μl Transfektionsmedium und 1,5 ml Serum und antibiotikafreiem DMEM/F12K-Medium bei einer endgültigen miRNA-Konzentration von 100 nM. Die miRNA-Menge kann eine Optimierung auf verschiedenen Zellen und Konzentrationen erfordern. Geeignete Ansätze umfassen die Transfektion von Zellen mit steigenden Konzentrationen von miRNA (d.h. 50-200 nM) und die Bewertung der Expressionsherunterregulierung der interessierenden Gene.
- Nehmen Sie das Nährmedium aus dem Kolben/der Platte und waschen Sie es einmal mit 1x PBS.
- miRNA/Scramble-Transfiktionsmittel-Komplexe zugeben und bei 37 °C mit 5 % CO2 für 6 h inkubieren (die Kolbengröße definiert das hinzugefügte Inkubationsvolumen).
- Ersetzen Sie das Medium durch 4 ml Kulturmedium und inkubieren Sie die Zellen für 24 h und/oder 48 h.
2. Proteinexpression durch Antikörper-Zellzyklus-Microarray
- 5 x 105 Zellen für jede Probe in T25 cm2 Kolben aussäen und eine Transfektion gemäß dem in Abschnitt 1, Schritte 1-5 beschriebenen Protokoll durchführen.
- Nach 24 h und 48 h werden die Zellen durch Trypsinisierung geerntet.
- Übertragen Sie die Zellsuspensionen auf 15-ml-Röhrchen und markieren Sie sie entsprechend.
- Bei 751 x g 5 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
- 2 mL eiskaltes 1x PBS zugeben, vortexen und 5 min bei 751 x g zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.
- Wiederholen Sie den Waschschritt mit 1x PBS.
- Fügen Sie 150 μl Lysepuffer hinzu, der mit Proteaseinhibitoren ergänzt ist. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Zellmembranen aufzubrechen.
- Um eine Interferenz mit dem Lysepuffer zu vermeiden, führen Sie einen Pufferaustausch durch, um den Lysepuffer durch einen Markierungspuffer zu ersetzen, wobei Sie die Lösungsmittelaustauschsäulen des Herstellers verwenden.
- Quantifizieren Sie das Gesamtprotein mit einem BCA-Assay.
- Entnehmen Sie 70 μg Proteinprobe und fügen Sie Markierungspuffer hinzu, um ein Endvolumen von 75 μl zu erreichen.
- 100 μl Dimethylformamid (DMF) zu 1 mg Biotin-Reagenz (Biotin/DMF) hinzufügen.
- Geben Sie 3 μl Biotin/DMF zu jeder Proteinprobe (biotinylierte Proteinprobe) und inkubieren Sie 2 h bei RT.
- 35 μl Stoppreagenz zugeben und durch Vortexen mischen.
- Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei RT.
- Nehmen Sie die Microarray-Objektträger aus dem Kühlschrank, so dass sie vor der Verwendung 1 h lang auf RT erwärmen
.
- Führen Sie eine Blockierung für unspezifische Bindung durch, indem Sie die Objektträger mit 3%iger Trockenmilchlösung (in einem vom Hersteller bereitgestellten Blockierungsreagenz) in einer Petrischale unter kontinuierlichem Schütteln für 45 Minuten bei RT inkubieren.
- Waschen Sie die Rutschen mit ddH2O Wasser (wenn nicht anders angegeben, erfolgt die Wäsche mit ddH2O).
- Wiederholen Sie den Waschschritt ~10x, um die blockierende Lösung vollständig von den Objektträgeroberflächen zu entfernen. Dies ist wichtig, um einen gleichmäßigen und niedrigen Hintergrund zu erreichen.
- Entfernen Sie überschüssiges Wasser von den Rutschenoberflächen und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, ohne die Rutschen trocknen zu lassen.
- Bereiten Sie die Kopplungslösung vor, indem Sie 3 % Trockenmilch in einem Kopplungsreagenz auflösen.
- 6 ml der Kopplungslösung und zur vollen Menge der zuvor vorbereiteten biotinylierten Proteinprobe aus Schritt 12 hinzufügen.
- Legen Sie einen Objektträger in eine Vertiefung der vom Anbieter bereitgestellten Kopplungskammer und fügen Sie ~6 mL Proteinkupplungsmischung hinzu.
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass der Objektträger vollständig in die Proteinkupplungsmixlösung eingetaucht ist.
- Die Koppelkammer wird abgedeckt und 2 h bei RT unter kontinuierlichem Rühren in einem Orbitalschüttler inkubiert.
- Übertragen Sie die Objektträger in eine Petrischale und fügen Sie 30 mL 1x Waschpuffer hinzu. Stellen Sie die Petrischale in einen Orbitalschüttler, schütteln Sie sie 10 Minuten lang und entsorgen Sie die Lösung.
- Wiederholen Sie Schritt 24 2x.
- Spülen Sie die Objektträger ausgiebig mit ddH2O Wasser ab, wie in den Schritten 17 und 18 beschrieben, und fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort, um ein Austrocknen zu vermeiden.
- 30 μl Cy3-Streptavidin (0,5 mg/ml) in 30 ml Nachweispuffer geben.
- Legen Sie den Objektträger in eine Petrischale und fügen Sie 30 ml Nachweispuffer hinzu, der Cy3-Streptavidin enthält.
- Inkubieren Sie 20 Minuten lang in einem Orbitalschüttler unter ständigem Schütteln vor Licht.
Anmerkung: Cy-3 ist ein fluoreszierender Farbstoff. Mit Aluminiumfolie abdecken oder unter dunklen Bedingungen betreiben, um die Fluoreszenzintensität zu erhalten.
- Führen Sie die Schritte 24-26 durch und lassen Sie den Objektträger mit einem sanften Luftstrom trocknen oder legen Sie den Objektträger in ein konisches 50-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie ihn 5-10 Minuten lang bei 1300 x g.
- Legen Sie die Folie in den Folienhalter und decken Sie sie mit Alufolie ab.
- Scannen Sie den Objektträger in einem Microarray-Scanner mit den entsprechenden Anregungs- und Emissionswellenlängen. Im Fall von Cy3 liegt der Peak der Anregungswellenlänge bei ~550 nm und der Emissionspeak bei ~570 nm.
- Analysieren Sie die Daten (siehe Materialtabelle für die verwendete Software).