Lungenvorbereitung der Maus für die Durchflusszytometrie: Erzeugung von Zellsuspension aus Lungengewebe für die durchflusszytometrische Analyse

Zusammenfassung

Quelle: Moll, H. P., et al. Orthotope Transplantation von syngenen Lungenadenokarzinomzellen zur Untersuchung der PD-L1-Expression. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video beschreibt die Vorbereitung einer Lungenzellsuspension aus der Maus für die durchflusszytometrische Analyse zur Untersuchung der PD-L1-Expression von Lungenadenokarzinomzellen.

Protokoll

Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Lungenvorbereitung für die Durchflusszytometrie

1. Am gewünschten experimentellen Endpunkt sediert man die Maus durch eine subkutane Injektion einer Mischung aus Ketamin (100 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (10 mg/kg Körpergewicht) und euthanasiert sie durch Zervixluxation.
2. Weichen Sie den Kadaver in 70%igem Ethanol ein und befestigen Sie die Maus mit Klebeband auf einem Sezierbrett
.
3. Machen Sie einen Schnitt an der ventralen Mittellinie und invertieren Sie die Haut sanft, um die Brustwandmuskulatur und die Bauchorgane freizulegen. Punktieren Sie das Zwerchfell und schneiden Sie die Rippen mit einer Schere auf, um die Brusthöhle freizulegen.
4. Perfundieren Sie die Lunge 3x mit 6 - 8 mL eiskaltem PBS durch die rechte Herzkammer mit einer 27 G Nadel, nachdem Sie eine kleine Öffnung in die linke Herzkammer geschnitten haben, damit das Blut austreten kann. Die Lunge sollte von Blut befreit sein und sich vollständig weiß färben.
5. Nehmen Sie die Lunge heraus und hacken Sie die Lappen mit einer Schere in kleine Stücke. Übertragen Sie die Lungenstücke in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie es in 1,5 mL Lungenverdauungspuffer (RPMI, 5 % FCS, 150 U/mL Kollagenase I und 50 U/mL DNase I).
6. Inkubieren Sie die Lungenteile 30 - 60 min bei 37 °C und ständigem Schütteln.
7. Die Lungenzellsuspension wird durch ein 70 μm Zellsieb in ein 50 mL Röhrchen überführt. Reinigen Sie das Sieb mit der Rückseite einer sterilen 10-ml-Spritze und spülen Sie das Sieb mit 15 mL PBS mit 2 % FCS.
8. Die Zellen werden bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand aspiriert. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Ammoniumchlorid-Kalium (ACK)-Lysingpuffer und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur für die Lyse der verbleibenden Erythrozyten.
9. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min bei 4 °C und resuspendieren Sie die Zellen in 1 mL PBS mit 2% FCS und fahren Sie mit dem gewünschten Färbeprotokoll für die Durchflusszytometrie fort
   Anmerkung: Alternativ können die Zellen in RPMI, das 30 % FCS und 10 % DMSO enthält, resuspendiert und unter Verwendung eines Gefrierbehälters für eine spätere Analyse eingefroren werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Adenokarzinom-Zelllinie der Mauslunge			Isoliert im eigenen Haus
C57Bl/6 Mäuse			F1 des Kreuzes der beiden Hintergründe kann verwendet werden (8-12 Wochen)
129S Mäuse
RPMI 1640 Mittel	Lebenstechnologien	11544446
Fötales Kälberserum	Lebenstechnologien	11573397
Penicillin/Streptomycin-Lösung	Lebenstechnologien	11548876
L-Glutamin	Lebenstechnologien	11539876
Ketasol (100 mg/ml Ketamin)	Ogris Pharma	Tel.: 8-00173
Xylasol (20 mg/ml Xylazin)	Ogris Pharma	Tel.: 8-00178
Stumpfe Pinzette	Roboz	RS8260
Schülerin Iris Schere	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Artikel-Nr.: 91460-11
DNase I (RNase-frei)	Neuengland Biolabore	M0303S
Kollagenase Typ I	Lebenstechnologien	17100017
ACK Lysing-Puffer	Lonza	10-548E