Immunfluoreszenz-Assay: Eine Methode zur Identifizierung von Tumorzellen, die auf einem medizinischen Draht eingefangen wurden

Zusammenfassung

Quelle: Gallerani, G. et.al., Charakterisierung von Tumorzellen unter Verwendung eines medizinischen Drahtes zum Einfangen zirkulierender Tumorzellen: Ein 3D-Ansatz basierend auf Immunfluoreszenz und DNA-Fischen. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video beschreibt die Technik der Immunfluoreszenzfärbung von zirkulierenden Tumorzellen, die auf einem funktionalisierten medizinischen Draht eingefangen wurden. Der funktionalisierte Draht ermöglicht die Isolierung von CTCs in vivo direkt aus dem Blutkreislauf des Patienten.

Protokoll

1. Immun-DNA FISH auf Draht

1. Spike-in der Zelllinie auf Draht (3D-Unterstützung)
   Anmerkung: Die Vorabvorbereitung beinhaltet eine genaue Auswahl der adhärenten Zelllinien auf der Grundlage der EpCAM-Positivität. Der Draht ist mit Anti-EpCAM-Antikörpern funktionalisiert, so dass nur EpCAM-positive Zellen gefärbt werden.
   Anmerkung: Berühren Sie nicht den funktionalisierten Teil des Drahtes, um Beschädigungen zu vermeiden.
   Anmerkung: Alle Schritte sollten unter einer Laminar-Flow-Haube unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
   1. Resuspendieren Sie den gesamten Inhalt eines T75-Kolbens (80 % Konfluenz) in einem 5-ml-Fläschchen mit 4 mL vollständigem Medium; für einen einzelnen Spike-in werden etwa 2.000.000 Zellen empfohlen, um die Adhäsion der Zellen am Draht zu maximieren.
   2. Nehmen Sie den Draht aus der Glasverpackung.
   3. Tauchen Sie den funktionalisierten Goldteil des Drahtes in das Fläschchen und stellen Sie sicher, dass der Drahtstopfen wasserdicht für das Fläschchen passt. Mit Laborfolie versiegeln.
      Anmerkung: Die Verwendung eines 5-ml-Röhrchens wird empfohlen, um eine korrekte Übereinstimmung zwischen dem Drahtstopfen und dem Fläschchen zu ermöglichen.
   4. 30 min bei RT in einem Röhrenrotator (0-120 Winkel) inkubieren.
   5. Spülen Sie den Draht dreimal in 1× PBS-Lösung mit 3 verschiedenen sauberen Fläschchen.
2. Fixierung und Permeabilisierung
   Vorsicht: Aceton ist eine brennbare Substanz, die die Atemwege reizen kann. Verwenden Sie nur acetonbeständige Kunststoffe oder Glasbehälter (kein PVC oder PVDF).
   Anmerkung: Führen Sie diese Schritte unter einem chemischen Abzug durch.
   1. Trocknen Sie den Draht an der Luft.
   2. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie den Draht 10 Minuten lang bei RT in 100%ige Acetonlösung tauchen. Verwenden Sie ein 5-ml-Röhrchen.
      Anmerkung: Der Drahtstopfen darf nicht mit dem Fixiermittel in Berührung kommen.
   3. Trocknen Sie den Draht 5 Minuten lang an der Luft bei RT.
      Anmerkung: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Der Draht muss bei -20 °C gelagert werden. Wenn Sie den Draht für die Langzeitlagerung verpacken, platzieren Sie den Drahtstopper neben der funktionalisierten Spitze und führen Sie den Draht vorsichtig in das Aufbewahrungsglasrohr ein, wobei Sie darauf achten, dass die funktionalisierte Spitze nicht beschädigt wird. Schließen Sie das Vorratsglas und lagern Sie es (vertikal oder horizontal) bei -20 °C.
3. Immunfluoreszenz Tag 1
   Anmerkung: In dieser Phase wird eine Inkubation über Nacht (~ 16 h) durchgeführt.
   1. Zweimal in 1× PBS-Lösung mit einem 5-ml-Schlauch waschen.
   2. Inkubieren Sie den Draht 30 Minuten lang in Antikörperverdünnungspuffer bei RT mit einem 5-ml-Röhrchen.
   3. Bereiten Sie 150 μl Antikörpermischung mit einer Verdünnung von monoklonalen Primärantikörpern, konjugiert mit Fluorochrom, in Antikörperverdünnungspuffer vor, wie im Datenblatt angegeben. Zum Beispiel wurde EpCAM-FITC-Antikörper mit einer Verdünnung von 1:20 verwendet.
   4. Verwenden Sie eine p200-Spitze, um die Inkubation wie folgt durchzuführen: Ziehen Sie den Draht aus dem Drahtstopfen heraus und führen Sie den Draht vorsichtig durch das größere Loch der Spitze ein. Führe zuerst das unfunktionalisierte Ende ein und ziehe den Draht langsam durch das kleinere Loch, bis der Goldteil knapp hinter dem größeren Loch ist.
   5. Geben Sie vorsichtig 150 μl des Antikörpermixes (z. B. Anti-EpCAM_FITC-Antikörper 1:20 verdünnt) in die Spitze. Um die Gefahr der Blasenbildung zu vermeiden, drehen Sie den Draht vorsichtig, bis das funktionalisierte Teil vollständig eingetaucht ist.
   6. Verschließe das Loch der Spitze. Das Wickeln von Laborfolie um das Loch kann helfen.
   Über
   7. Nacht (~ 16 h) im Dunkeln bei 4 °C vertikal inkubieren.
4. Immunfluoreszenz Tag 2
   1. Blockieren Sie die Antikörperinkubation, indem Sie den Draht zweimal in 1× PBS waschen.
   2. Stecken Sie den Draht wieder in den Drahtstopper.
      Anmerkung: In 1X PBS bei 4 °C in einem 5-ml-Fläschchen lagern, bis der FISH-Assay durchgeführt wird.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ethanol	Carlo Erba	# 414605
Tween 20	BIO RAD	# 1706531
PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung)	Medicago	# 09-9400-100
Aceton	Sigma Aldrich	# 534064-500ML
GUMMIZEMENT	Königliches Talens	# 95306500
EpCAM-FITC (Klon: HEA-125)	Mitenyi	#130-080-301
RPMI 1640	Gibco	# 31870-025
XT ALK BA	MetaSystems-Sonden	# D-6001-100-OG
Detektor CANCER01 EpCAM	Gilupi Nanomedizin		Funktionalisierter Draht
ZEISS Fluoreszenzmikroskop Axioskop	Zeiss
Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 Bit Software	Nikon
Nikon DS-QiMc 12 Bit Digitalkamera	Nikon	DS-QiMc