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1. Entnahme von Plasmaproben
- 10 ml Vollblutprobe in Vacutainer-Röhrchen mit Sprühbeschichtung K2EDTA entnehmen und bei Raumtemperatur lagern.
Anmerkung: Um die Hämolyse zu minimieren, trennen Sie das Plasma innerhalb von 2 h. Lagern Sie das Vollblut nicht bei niedrigen Temperaturen (z. B. 4 °C), um Temperaturschocks und Zelllyse zu vermeiden, die zu einer unspezifischen miRNA-Freisetzung führen.
- Innerhalb von 1 h das Plasma durch einen ersten Zentrifugationsschritt bei 1.258 x g und 4 °C für 10 min abtrennen.
- Den Plasmaüberstand in ein 15-ml-Röhrchen überführen und dabei den Kontakt mit dem Lymphring sorgfältig vermeiden.
- Zentrifugieren Sie das Plasma ein zweites Mal bei 1.258 x g und 4 °C für 10 min.
- Aliquotieren Sie 1 ml Plasma in 1,5 ml-Kryoröhrchen, wobei eine Ansammlung der Plasmafraktion am Boden des Röhrchens vermieden wird.
- Alle Aliquote werden bei -80 °C gelagert, mit Ausnahme eines für die Beurteilung der Hämolyse. Die molekulare Analyse sollte innerhalb von 5 Wochen durchgeführt werden.
2. Plasma-Gesamt-RNA-Extraktion
- Bereiten Sie eine 1-Thioglycerin/Homogenisierungslösung (OMG) mit 20 μl 1-Thioglycerin pro ml Homogenisierungslösung vor. Da 1-Thioglycerol viskos ist, pipettieren Sie vorsichtig für eine genaue Messung. Die OMG Lösung vor der Verwendung auf Eis oder bei 2-10 °C kalt stellen.
Anmerkung: Die Arbeitslösung ist 1 Monat lang bei 2-10 °C stabil.
- Suspendieren Sie die lyophilisierte DNase I, indem Sie 275 μl nukleasefreies Wasser in das Fläschchen geben und vorsichtig mischen (nicht vortexen). Als visuelle Hilfe fügen Sie der rekonstituierten DNase I 5 μl blauen Farbstoff hinzu und geben Sie die Lösung in Nuklease-freien Röhrchen in Einmal-Aliquoten ab. Rekonstituierte DNase I bei -30 °C bis -10 °C lagern.
- Ausgehend von 200 μl Plasma fügen Sie 200 μl der gekühlten OMG-Lösung hinzu.
- Vortex 15-30 s, um eine vollständige Homogenisierung zu gewährleisten. Wenn Schaumbildung auftritt, lassen Sie die Probe auf Eis absetzen.
- Geben Sie 200 μl Lysepuffer und 25 μl Proteinase K in die homogenisierte Probe und wirbeln Sie sie 20 s lang.
- Die Proben werden 15 Minuten lang in einem auf 37 °C vorgeheizten Thermomischer inkubiert.
- Legen Sie für jede Probe eine Kartusche in das Deckfach des Instruments und setzen Sie den Stecker in die richtige Position.
- Übertragen Sie das Lysat an die entsprechende Position in der Instrumentenpatrone.
- Geben Sie 5 μl DNase I-Lösung an die richtige Position in der Patrone.
- Geben Sie 60 μl nukleasefreies Wasser auf den Boden jedes Elutionsröhrchens.
- Wählen Sie die Methode "RSC miRNA Tissue" und starten Sie den automatisierten Aufreinigungslauf. Die gesamten RNA-Proben können bei -80 °C gelagert werden.