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1. GMA-Schnitte.
- Bereiten Sie eine 0,05%ige Ammoniaklösung mit destilliertem Wasser vor. Legen Sie das Glasmesser und die Biopsie in das Mikrotom. Richten Sie den Biopsieblock vorsichtig mit der Klinge aus, indem Sie den Messerhalter und den Winkel des Biopsieblocks so einstellen, dass die Klinge flach auf der Oberfläche des Blocks aufliegt.
- Schneiden Sie mit dem Mikrotom bei langsamer Schnittgeschwindigkeit 2 μm dicke Abschnitte und übertragen Sie die Schnitte mit einer Pinzette auf das Ammoniakwasser und schwimmen Sie sie aus. Bewegen Sie die Schnitte 45-90 Sekunden lang, um eine sanfte Antigenentnahme und -entfaltung des Schnitts zu ermöglichen.
- Nehmen Sie Schnitte mit Objektträger auf. Überprüfen Sie die Histologie der Biopsie, indem Sie schnell mit Toluidinblau färben.
- Trocknen Sie die Objektträger auf einer auf 50 °C eingestellten Heizplatte und tragen Sie mit einer Pasteur-Plastikpipette 500 μl gefilterte Toluidinblau-Beize auf einen Schnitt auf. Erwärme den Abschnitt auf der Herdplatte, bis ein grüner Ring am Rand des Flecks entsteht, und wasche ihn dann mit Wasser ab.
- Überprüfen Sie mit einem Lichtmikroskop die Histologie der Biopsie. Die für die Immunhistochemie verwendeten Schnitte sollten gute Bereiche mit unbeschädigter Lamina propria und Epithel enthalten, mit so wenig Drüsen und so wenig glatter Muskulatur wie möglich.
- Schneiden Sie Schnitte mit guter Histologie und nehmen Sie sie mit Poly-L-Lysin-beschichteten (PLL-beschichteten) Objektträgern für die immunhistochemische Färbung auf. Schneiden Sie mindestens zwei Schnitte von jeder Biopsie für die Analyse. Trocknen Sie die Objektträger für mindestens 1 Stunde. Nach dem Trocknen können die Abschnitte in Alufolie eingewickelt und bis zu 2 Wochen bei -20 °C gelagert werden, oder sie können sofort immungefärbt werden.
2. Immunhistochemische Färbung von GMA-eingebetteten endobronchialen Biopsien
HINWEIS: Natriumazid ist giftig. Bereiten Sie die 0,1%ige Natriumazidlösung in einem Abzug und fern von Säuren vor. Bei Kontakt mit Säuren werden giftige Gase freigesetzt.
- Zeichnen Sie mit einem Diamantstift um die Partien herum und ordnen Sie die Objektträger auf einem Färbegestell an.
- Führen Sie einen Peroxidase-Block durch. Bereiten Sie eine Peroxidase-Blocklösung aus 0,3 % Wasserstoffperoxid in 0,1 % iger Natriumazidlösung vor. 1 ml des Peroxidase-Blocks auf die Schnitte auftragen und 30 Minuten inkubieren.
- Bereiten Sie eine Waschlösung mit 0,05 M Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) mit einem pH-Wert von 7,6 vor. Waschen Sie die Objektträger in TBS, 3x 5 min.
- Bereiten Sie eine 1%ige BSA-Blocklösung in DMEM vor. Tun Sie dies im Voraus und in großen Mengen, aliquotieren Sie es und frieren Sie es bis zur Verwendung ein. Entleeren Sie die Objektträger und inkubieren Sie die Schnitte 30 Minuten lang in Blocklösung, um eine unspezifische Antikörperbindung zu blockieren. Wenn immer noch eine unspezifische Bindung auftritt, ist ein 30-minütiger Inkubationsschritt mit einem 5%igen Serumblock von derselben Spezies wie der Sekundärantikörper einzuschließen.
- Verdünnen Sie den Primärantikörper (CD45 oder CD1a) in TBS auf die gewünschte Konzentration (CD45 verdünnt im Verhältnis 1:1.000; CD1a im Verhältnis 1:1,00 verdünnt) und auf Objektträger auftragen. Decken Sie die Abschnitte ab und inkubieren Sie sie über Nacht bei RT.
- Waschen Sie die Objektträger dreimal in TBS. Biotinylierter Sekundärantikörper (gerichtet gegen die primäre Antikörper-Wirtsspezies, in diesem Fall Kaninchen-Anti-Maus F(ab'2)) in TBS auf die gewünschte Konzentration (1:300 Verdünnung) verdünnen und auf Objektträger auftragen. Inkubieren Sie für 2 Stunden bei RT.
- Bereiten Sie mindestens 30 Minuten vor Gebrauch einen Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex vor. Stellen Sie sicher, dass genügend Folien vorhanden sind, um alle Objektträger abzudecken. Waschen Sie die Objektträger dreimal in TBS. Tragen Sie die Lösung auf die Objektträger auf und inkubieren Sie sie 2 Stunden lang bei RT.
- Waschen Sie die Objektträger dreimal in TBS. Bereiten Sie eine 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC)-Peroxidase-Substratlösung vor (hergestellt gemäß den Anweisungen des Herstellers). Tragen Sie es auf die Objektträger auf und inkubieren Sie es 20-30 Minuten lang oder bis sich die gewünschte Färbeintensität entwickelt.
- Spülen Sie die Objektträger 5 Min. unter fließendem Leitungswasser ab. Färben Sie die Schnitte 2 Min. mit gefilterter Mayer-Hämatoxylin-Lösung gegen. Waschen Sie die Objektträger 5 Min. unter fließendem Leitungswasser.
- Lassen Sie die Objektträger ab und bedecken Sie die Abschnitte mit permanentem wässrigem Einbettmedium. Trocknen Sie die Objektträger bei 80 °C in einem Trockenofen. Lassen Sie die Dias abkühlen, montieren Sie sie dann mit DPX und platzieren Sie ein Deckglas.