Exosomenisolierung: Eine Technik zur Trennung von Exosomen aus dem Plasma von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs

Zusammenfassung

Quelle: Giallombardo, M., et al. Exosomale miRNA-Analyse im Plasma von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) mittels qPCR: ein praktikables Werkzeug für die Flüssigbiopsie. J. Vis. Exp.(2016).

Die plasmaisolierten Exosomen können als nicht-invasive und wiederholbare Methode zum Nachweis und zur Nachverfolgung der Biomarker zur Früherkennung und zum Fortschreiten der Krankheit verwendet werden. Dieses Video beschreibt das Protokoll für die Trennung von Exosomen aus den Plasmaproben von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, die für DNA- und Proteinextraktionen verwendet werden könnten.

Protokoll

1. Isolierung von Exosomen

Hinweis: Die Isolierung von Exosomen aus Plasmaproben wurde mit einem kommerziellen Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers und durch Hinzufügen einer RNAse Behandlung durchgeführt: (Alle diese Schritte müssen mit persönlicher und umweltbezogener Schutzausrüstung und nach einem speziellen gesetzlichen Verfahren für die Manipulation biologischer Proben durchgeführt werden).

1. Von jeder Probe wird 1 ml Plasma entnommen, die bei -80 °C gelagert wird, und auf Eis gelegt.
2. Die Probe wird bei 2.000 × g für 20 min bei RT zentrifugiert; diese Passage ist zwingend erforderlich, um Zellen und Ablagerungen zu entfernen.
3. Der Überstand mit dem sauberen Plasma wird in ein neues 1,5-ml-Röhrchen überführt.
4. Zentrifugieren Sie das neue Röhrchen bei 10.000 × g für 20 min bei RT.
5. Der Überstand mit dem sauberen Plasma wird in ein neues 1,5-ml-Röhrchen überführt.
6. Geben Sie 100 ng/ml RNAse in den Überstand und inkubieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei 37 °C, um zirkulierende RNAs abzubauen.
7. Übertragen Sie das gesamte behandelte Plasma in ein neues 2-ml-Röhrchen und fügen Sie 0,5 Volumen 1x PBS hinzu.
8. Wirbeln Sie die Probe, um die Lösungen zu mischen.
9. Geben Sie 0,05 Volumen Proteinase K-Lösung (im Kit enthalten) in die Probe.
10. Die Probe vortexen und dann 10 Minuten lang bei 37 °C inkubieren.
11. Geben Sie 0,2 Volumen Exosomen-Fällungspuffer in die Probe und mischen Sie die Lösungen durch Inversion.
12. Inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang bei 2 °C bis 8 °C und zentrifugieren Sie die Probe dann 5 Minuten lang bei RT bei 10.000 × g.
13. Aspirieren Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn. Das Pellet enthält die isolierten Exosomen.
14. Geben Sie ausgewählten Puffer zum Exosomenpellet, um die Exosomen zu resuspendieren. Die Auswahl des Puffers hängt von der geplanten Downstream-Analyse ab, in diesem Fall:
    1. Fügen Sie 100 μl 1x PBS hinzu, um eine TEM-Analyse durchzuführen.
    2. Fügen Sie 346,5 μl spezifischen Lysepuffer für die RNA-Extraktion hinzu (aus kommerziellem Kit) (VORSICHT: chemische Gefahr).
    3. Fügen Sie 100 μl Lysepuffer für die Proteinextraktion hinzu (Tris-HCl 50 mM, pH 7,6 - NaCl 300 mM - Triton X-100 0,5% - PMSF 1 mM - Leupeptin/Aprotinin 10 μg/ml), um die Western-Blotting-Analyse durchzuführen. (ACHTUNG: chemische Gefahren).
15. Lagern Sie die resuspendierten Exosomen bei -20 °C.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Vollständiges Exosomen-Isolationskit (aus Plasma)	Invitrogen	4484450	Verwenden Sie die Proteinase K-Behandlung
Ribonuklease A	Sigma-Aldrich	Nr. R4875-100MG
RNAspin Illustra Mini-Bausatz 50	GE HealthCare	Tel.: 25-0500-71

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