3D-DNA-Fisch: Eine Technik zur Lokalisierung eines bestimmten Gens auf einem Chromosom

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Gallerani, G. et.al. Charakterisierung von Tumorzellen mit einem medizinischen Draht zum Einfangen zirkulierender Tumorzellen: Ein 3D-Ansatz basierend auf Immunfluoreszenz und DNA-Fischen. J. Vis. exp. (2017).

Die Isolierung und Charakterisierung zirkulierender Tumorzellen (CTC) aus dem Blut von Krebspatienten ist eine Art nicht-invasiver Flüssigbiopsie und wird mit einem Rückfall und Krankheitsverlauf in Verbindung gebracht. Dieses Video beschreibt die Technik der DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (DNA FISH) an CTCs, die auf einem medizinischen Draht eingefangen wurden, um ein spezifisches Gen von Interesse zu untersuchen.

Protokoll

1. 3D DNA-FISH Tag 2

ACHTUNG: Besonderes Augenmerk muss auf die hohe Temperatur der Instrumente und der Feuchtkammer gelegt werden.

Richten Sie den Hybridisierungsofen und den Trockenhitzeschrank ein (~ 3 h vor dem Start des DNA-FISH-Protokolls). Stellen Sie den Hybridisierungsofen auf 75 °C ein, stellen Sie den Trockenheizofen auf 37 °C und kühlen Sie die 0,4× SSC-Lösung (pH = 7,0 ± 0,1) auf 4 °C ab.
Anmerkung: Der pH-Wert von FISH-Puffern ist kritisch und muss 7,0 ± 0,1 betragen.
Waschen Sie den Draht 3 Mal in eiskalter 0,4× SSC-Lösung.
Anmerkung: Halten Sie den Draht im Dunkeln, um Fluorochrom-Photobleichung während der folgenden Verfahren zu vermeiden.
10 min im Dunkeln unter dem Abzug trocknen.
Wirbeln Sie die Sonde und drehen Sie sie 5 s lang.
Lassen Sie 10 μl der Sonde in die Glasmikroröhrchen fallen. Abdeckung mit Laborfolie.
Schleudern Sie die Mikroröhrchen wie folgt: Wickeln Sie das Mikroröhrchen in ein trockenes Absorptionsmittel, legen Sie das Papier in ein 50-ml-Röhrchen und drehen Sie es kurz.
Legen Sie den getrockneten Draht vorsichtig in das Mikroröhrchen und setzen Sie den Drahtstopfen ein. Mit Gummizement abdichten.
Vorsicht: Die nächsten beiden Schritte sind mit hohen Temperaturen verbunden. Tragen Sie Schutzhandschuhe.
Legen Sie den Draht für 8 Minuten bei 75 °C in eine dunkle, feuchte Kammer in den Hybridisierungsofen, um eine vollständige DNA-Denaturierung zu erhalten.
Stellen Sie die Feuchtkammer über Nacht in einen trockenen Backofen mit 37 °C warmer Hitze.

>2. 3D DNA-FISH Tag 3

Einen Objektträger-Färbebehälter mit 0,4× SSC-Lösung in ein Wasserbad geben und auf 72 °C einstellen.
Die Temperatur der SSC-Lösung von 0,4 × prüfen, bis sie 72 ± 1 °C erreicht.
Bereiten Sie zwei Bechergläser vor, eines mit 2× SSC + 0,05% Tween-Lösung (pH = 7,0 ± 0,1) und das zweite mit destilliertem Wasser.
Nehmen Sie die feuchte Kammer aus dem Ofen mit trockener Hitze, entfernen Sie vorsichtig mit einer Pinzette den Gummizement vom Drahtstopfen und nehmen Sie den Draht heraus.
Anmerkung: Ziehen Sie das unbeschichtete Ende des Drahtes vorsichtig durch den IN-Stopper und achten Sie darauf, die funktionsfähige Spitze nicht zu beschädigen.
Tauchen Sie den Draht 2 Minuten lang bei 72 °C in die 0,4× SSC-Lösung.
Den Draht in 2× SSC + 0,05%iger Tween-Lösung 30 s bei RT waschen.
Waschen Sie den Draht in destilliertem Wasser bei RT.
Trocknen Sie den Draht unter dem Abzug 10 Minuten lang im Dunkeln.
Bereiten Sie eine DAPI-Stammlösung von 1,43 μM in 2 mL 1× PBS vor.
Inkubieren Sie die funktionalisierte Spitze des Drahtes mit DAPI-Lösung in einem 2-ml-Fläschchen für 1 h im Dunkeln bei RT.
Spülen Sie den Draht zweimal in 1× PBS ab und trocknen Sie ihn an der Luft.

3. 3D Mikroskopbeobachtung und -analyse

Positionieren Sie den Draht im Drahthalter. Führen Sie die funktionalisierte Spitze vorsichtig durch die Eintrittsöse des speziellen Halters, bis die Spitze mit dem Kupplungspunkt übereinstimmt. Achten Sie darauf, die funktionalisierte Spitze nicht zu beschädigen (Abbildung 1a).
Setzen Sie die spezielle Halterung auf den Mikroskoptisch. Stellen Sie den Fokus des Mikroskops mit einem 20×Objektiv ein. Fokussieren Sie zunächst grob auf den speziellen Träger und justieren Sie dann fein auf Zellen, die im DAPI-Kanal hell erscheinen.

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Ergebnisse

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Abbildung 1: Funktionalisierter Draht, schematische Anordnung der ALK-Break-Apart-Sonden, Schema der erwarteten Muster der ALK-Umlagerung und spezieller Halter.(a) Rote Kästchen markieren die drei Hauptteile des Drahtes: funktionalisierte Spitze, Drahtstopper und nicht funktionalisierte Spitze. Die funktionalisierte Spitze ist der empfindlichste Teil des Drahtes u...