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1. Fixierung und Verarbeitung der Gewebeschnitte
- Heben Sie die unkultivierte 0-h-Referenz oder die kultivierte Scheibe vorsichtig auf ein mit PBS getränktes Filterpapier.
- Geben Sie dazu 2-3 mL PBS auf ein Filterpapier, das in eine 10 cm dicke Platte gelegt wird. Legen Sie die Scheibe auf das Filterpapier und heben Sie das Filterpapier mit einer Pinzette heraus.
- Übertragen Sie das Filterpapier in eine Histokassette und geben Sie einen Tropfen verdünntes Hämatoxylin (1:1 in deionisiertem Wasser) auf die Gewebescheibe, um die Position der Scheibe während der nachfolgenden Verarbeitungsschritte sichtbar zu markieren (Abbildung 1D).
- Schließen Sie die Kassette und geben Sie sie in eine 4%ige neutrale gepufferte Formalinlösung. Fixieren Sie die Taschentücher über Nacht bei 4 °C.
Anmerkung: Achten Sie beim Auflegen der Scheibe auf das Filterpapier darauf, dass der obere Teil der Scheibe nach oben zeigt. Dies ist notwendig, um den oberen, mittleren und unteren Schnitt einer Schicht während des Schnitts und der Analyse zu verfolgen, wie in Schritt 2.3 beschrieben.
- Übertragen Sie die Kassetten am nächsten Tag in 70 % EtOH und fahren Sie sofort mit dem Verarbeitungsschritt des paraffineinbettenden Gewebes fort.
- Waschen Sie die Histocasetten vor der Gewebeaufbereitung in 100% EtOH 2x für jeweils 10 min. Verwenden Sie in diesem Fall eine Mikrowellenstation für die Gewebeverarbeitung. Wählen Sie das verwendete Programm für eine Gewebedicke von 1 mm und befolgen Sie die Anweisungen im Handbuch (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf).
Anmerkung: Wenn Sie andere Tissue-Verarbeitungsmaschinen verwenden, verwenden Sie das Programm, das für dünne Gewebeproben geeignet ist.
- Öffnen Sie zum Einbetten von Paraffin eine Histokassette und heben Sie die Scheibe vorsichtig mit einem Skalpell vom Filterpapier ab. Entsorgen Sie das Filterpapier und geben Sie die Scheibe in eine Form mit flüssigem Paraffin.
- Drücken Sie das Gewebe gegen den Boden der Einbettform, z. B. mit einem flachen Gewicht, um eine gleichmäßige Schnittbildung zu gewährleisten. Legen Sie den unteren Teil der Histocasette auf die Form und fügen Sie flüssiges Paraffin hinzu. Lassen Sie die Form auf einer kalten Pastete 30 min abkühlen und trennen Sie die Form vom Paraffinblock.
Anmerkung: Als Alternative zur horizontalen Einbettung ist es möglich, den Tumorschnitt vertikal einzubetten, indem der Schnitt in einer aufrechten Position positioniert wird. Vertikale Schnitte ermöglichen ohne weiteres die Analyse von Gradienten in der Lebensfähigkeit oder der funktionellen Markerausprägung auf einem einzigen Schnitt. Die Gradientenanalyse mit horizontal eingebetteten Schichten erfordert eine Paraffinschnitte, wie in Schritt 2.2 beschrieben.
2. Verarbeitung und Analyse von formalinfixierten und paraffineingebetteten (FFPE) Geweben
- Bereiten Sie 4 μm dünne Schnitte der FFPE-Gewebeschnittblöcke mit einem Mikrotom vor. Beim Schneiden den Winkel des Blocks so einstellen, dass die Oberfläche des Blocks horizontal in Bezug auf die Klinge ausgerichtet ist; Dies ist notwendig, um gleichmäßige Schnitte im gesamten Gewebe zu erhalten.
- Um die Erfassung eines potenziell kulturinduzierten Viabilitätsgradienten, der Zellmigration über die Scheiben oder von Gradienten in der Biomarkerexpression über kultivierte Schnitte zu ermöglichen, sammeln Sie Schnitte aus der oberen, mittleren und unteren Schicht jeder Gewebescheibe auf Objektträgern, wie unten erläutert.
- Sammeln Sie sequenzielle Gewebeschnitte der in Paraffin eingebetteten Gewebescheibe zuerst auf dem oberen Teil der Objektträger. Sammeln Sie die Schnitte der tieferen Gewebeschichten weiter zur Mitte, gefolgt vom unteren Teil der Objektträger (Abbildung 1E).
Anmerkung: Um drei Abschnitte auf einem Objektträger unterzubringen, schneiden Sie den Paraffinüberschuss ab, der die eingebettete Gewebescheibe umgibt.
- Lassen Sie die Schnitte über Nacht bei 37 °C trocknen und fahren Sie mit der H&E-Färbung oder Immunhistochemie wie unten beschrieben fort.
Anmerkung: Ein Verlust der Antigenität kann auftreten, wenn FFPE-Schnitte bei hohen Temperaturen oder über längere Zeiträume gelagert werden. Es wird empfohlen, Paraffinschnitte bei 4 °C zu lagern, und IHC-Analysen sollten innerhalb von 6 Monaten nach der Schnittung durchgeführt werden.
- Für die H&E-Färbung entparaffinisieren und rehydrieren Sie die Paraffinabschnitte wie folgt: Xylol 3x für 5 min, 100 % EtOH 3x für 1 min, 96 % EtOH 2x für 1 min, 70 % EtOH 1 x 1 min und deionisiertes Wasser 2x für 1 min.
- Inkubieren Sie die Schnitte 10 Minuten lang in frisch gefilterter Hämatoxylinlösung und waschen Sie sie 5 Minuten lang unter fließendem Leitungswasser. Tauchen Sie die Schnitte 2 Mal in sauren Alkohol (1 % HCl in 70 % EtOH) und waschen Sie sie 5 Minuten lang unter fließendem Leitungswasser, gefolgt von einer Inkubation mit 0,5 % Eosin für 2 Minuten.
- Nach dem Eosin-Schritt entwässern Sie die Schnitte, indem Sie die Objektträger wie folgt in Alkohol und Xylollösungen tauchen: 96 % EtOH 2x für 15 s, 100 % EtOH 3x für 30 s, Xylol 3x für 1 min. Zum Schluss betten Sie die Abschnitte in ein Einbettmedium auf Xylolbasis
ein.
