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>1. Vorbereitung der Zellen und des Mediums
- Bereiten Sie das Medium mit 240 ml Iscove's Modified Dubecco's Medium (IMDM) und 50 ml fötalem Rinderserum vor. Tauen Sie fötales Rinderserum nicht in einem heißen Wasserbad auf, da ein schneller Temperaturanstieg zu einer Beeinträchtigung der Serumstabilität führen kann. 240 μl Gentamicin 50 mg/ml und 5 ml Penicillin/Streptomycin 100x in einem Standardkulturkolben werden kombiniert und in das Medium gegeben. Lagern Sie das Medium bei 4 °C.
- U937-Zellen mit ~4 x 104 Zellen/ml in einem 25 cm 2 Kolben unter Verwendung des vorbereiteten Mediums säen. Beurteilen Sie die Konzentration und Lebensfähigkeit der Zellen mit einem TC20-Zellzähler und einem Trypanblau-Ausschluss, indem Sie 15-20 μl Zellen und 15-20 μl Trypanblau in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben und den Inhalt mischen. Pipettieren Sie 15-20 μl dieser Mischung in einen TC20-Probenahmeobjektträger und starten Sie die Zählung, indem Sie den Objektträger in den TC20-Zellzähler legen.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 und prüfen Sie die Zellviabilität mit dem Trypanblau-Ausschluss und dem TC20-Zellzähler. Wenn die Zellen eine angemessene Konzentration aufweisen und/oder über einen angemessenen Zeitraum mit Sonosensibilisatoren behandelt wurden, werden 3 ml Zellen aus dem Kulturkolben in ein 20-ml-Glasszintillationsfläschchen überführt. In diesem Protokoll werden U937-Zellen 48 Stunden lang gezüchtet und dann 30 Minuten lang mit 0,5, 1 oder 5 mM MeβCD behandelt, um das Cholesterin der Zellen vor der Beschallung ausreichend zu dezimieren.
>2. Zellbeschallung
- Entgasen Sie deionisiertes, destilliertes Wasser mit einem Vakuum und einem Buchnerkolben. Füllen Sie das Wasser in das Becherhorn und füllen Sie es bis zu einer Höhe von 15 mm über der Oberseite des Horns. Der Beschallungsprozess bewirkt eine weitere Entgasung des Wassers für einen Zeitraum von einigen Minuten und kann im Verlauf des Experiments zu Inkonsistenzen führen, wenn das System nicht vor der Probenbeschallung betrieben wird. Lassen Sie das System daher ~7 Minuten lang laufen, bevor Sie die Probe beschallen.
- Befestigen Sie das Szintillationsfläschchen mit den Zellen an der Haltevorrichtung. Befestigen Sie dann die Haltevorrichtung an der Oberseite des Becherhorns und stellen Sie sie auf eine Höhe von 15 mm von der Oberseite des Horns ein (an der Wasseroberfläche mit dem Schiebemechanismus).
- Die Zellen werden in der Regel mit drei Ultraschallimpulsen von 1 Sekunde beschallt, wobei zwischen jedem dieser Impulse ein Abstand von 1 Sekunde besteht. Für dieses Protokoll werden die Zellen mit einer Amplitude von 33 % und 50 % unter Verwendung der oben genannten Impulsdosierung beschallt.
>3. Bewertung von Zellen auf Schäden nach Beschallung
- Beurteilen Sie die suspendierten Zellen auf Schädigung und Lebensfähigkeit mit Trypanblau und dem TC20-Zellzähler. Analysieren Sie die Probe zusätzlich mit einem Z2-Zähler. Für die Z2-Gegenanalyse pipettieren Sie eine 100 μl Zellsuspension in 20 ml isotonische Kochsalzlösung (Verhältnis 200:1). Spülen Sie die Öffnung des Z2-Partikelanalysators vor der Analyse mindestens zweimal mit isotonischer Kochsalzlösung. Legen Sie die Z2-Probe in den Zählerhalter und heben Sie die Plattform zur Blende, bevor Sie mit der Zählung beginnen.
- Erfassen Sie die Daten von den TC20- und Z2-Zählern mit der vom Hersteller bereitgestellten Software. Analysieren Sie diese Daten auf Zellschäden, Lebensfähigkeit und die Entstehung von Zelltrümmern durch Beschallung.