XTT Assay: Ein kolorimetrischer Assay zur Beurteilung der Zellviabilität und der mitochondrialen Aktivität

Zusammenfassung

Trendowski, M., et al. Erzeugung und quantitative Analyse von gepulstem niederfrequentem Ultraschall zur Bestimmung der Schallempfindlichkeit von unbehandelten und behandelten neoplastischen Zellen. J. Vis. Exp. (2015)

Dieser Artikel beschreibt das Protokoll für den XTT-Assay, einen kolorimetrischen Assay zur Beurteilung der Zellviabilität und der mitochondrialen Aktivität.

Protokoll

1. XTT-Assay zur Bestimmung der Zellviabilität und mitochondrialen Aktivität von behandelten U937- und THP1-Zellen

1. Vor den XTT-Assays züchten Sie U937- und THP1-Zellen unter den gleichen Bedingungen. Die Zellen werden vor der Beschallung 30 Minuten lang mit dem gleichen Konzentrationsbereich wie MeβCD vorbehandelt. Verwenden Sie die gleichen Ultraschallparameter wie zuvor, mit der Ausnahme, dass die Zellen jetzt mit einem Bereich von 1-3 Impulsen pro Sekunde im Abstand von einer Sekunde beschallt werden, um einen Schadensbereich zu entwickeln, den das XTT-Kit beurteilen kann.
   Anmerkung: Viele dieser Schritte stammen direkt aus dem XTT-Kit-Handbuch und werden nur zur Bequemlichkeit interessierter Labore wiederholt.
2. Zellen durch Zentrifugation bei 200 x g für 10 min sammeln. Zellpellet in dem zuvor beschriebenen Wachstumsmedium resuspendieren. Resuspendieren Sie die Zellen mit ~1 x 10⁵ Zellen/ml. Satieren Sie U937-Zellen mit 100 μl pro Vertiefung in dreifacher Ausfertigung in eine 96-Well-Mikrotiterplatte mit flachem Boden und wiederholen Sie den Vorgang für THP1-Zellen mit einer separaten 96-Well-Platte. Fügen Sie 3 Kontrollvertiefungen mit 100 μl vollständigem Wachstumsmedium allein als blinde Absorptionsmesswerte hinzu. Inkubieren Sie dann die inokulierten Platten 24 Stunden lang.
3. Vor der Verwendung werden zwei Aliquots des XTT-Reagenzes und des Aktivierungsreagenzes bei 37 °C aufgetaut. Schwenken Sie die Aliquote vorsichtig, bis klare Lösungen erhalten werden. Fügen Sie 0,1 ml des Aktivierungsreagenzes zu 5,0 ml des XTT-Reagenzes hinzu, wodurch sich genügend aktivierte XTT-Lösung für einen 96-Well-Mikrotiterplatten-Assay bildet. Wiederhole den Vorgang für die andere Platte.
4. Geben Sie 50 μl der aktivierten XTT-Lösung in jede Vertiefung. Stellen Sie die Platte für 2 Stunden wieder in den CO₂ -Inkubator der Zellkultur. Schütteln Sie die Platte nach der Inkubationszeit vorsichtig, um die orange Farbe gleichmäßig in den positiven Vertiefungen zu verteilen. Messen Sie die Absorption der Assay-Wells, die die Zellen enthalten, und der blinden Hintergrund-Kontrollwells bei einer Wellenlänge zwischen 450 und 500 nm mit einem Mikrotiterplatten-Reader.
5. Setzen Sie den Mikrotiterplatten-Reader entweder mit den Blind-Kontrollvertiefungen auf Null oder subtrahieren Sie deren Durchschnittswert von den spezifischen Ergebnissen. Messen Sie die Absorption aller Assay-Wells erneut bei einer Wellenlänge zwischen 630 und 690 nm und subtrahieren Sie die Werte von den erhaltenen Werten von 450 bis 500 nm. Hinweis: Diese zweite Absorptionsbestimmung hilft, unspezifische Messwerte aus den Assay-Ergebnissen zu eliminieren. Der XTT-Assay wurde für beide Zelllinien viermal wiederholt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Iscove's Modified Dulbecco's Medium mit NaHCO3 & 25mM Hepes	Lebenstechnologien	12440079
Branson SLPe 40kHz Zelldisruptor mit 3" (25mm) Cuphorn	Branson Ultraschall	Tel.: 101-063-726	Beschallung Gerät
Tip One 100 μl und 1.000 μl Filterspitzen	USA Wissenschaftlich	Tel.: 1120-1840, 1126-7810
100 μl Mikropipette	Wheaton	851164
1000 μl Mikropipette	Wheaton	851168
Forma Scientific Zweikammer-Wasser Inkubator mit Mantel	Forma Scientific	Nr. 3131
XTT Zellproliferations-Assay-Kit	ATCC	30-1011K
96-Well-Mikroplatten-Reader	Cole-Palmer	Artikel-Nr.: EW-13055-54
U937 Humane monozytäre Leukämiezellen	ATCC	CRL1593.2
THP1 humane monozytäre Leukämiezellen	ATCC	TIB-202