1. Lösungen und Reagenzien
- Vollständiges RPMI
- Geben Sie 56 ml fötales Kälberserum (FCS) und 5,5 ml 200 mM L-Glutamin in eine 500 ml Flasche RPMI-1640 Medium.
- BrdU Stammlösung
- Bereiten Sie 32,5 mM BrdU (10 mg/ml) in Dulbecco-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (DPBS) vor.
- BrdU Komplettes RPMI
- Geben Sie 6,2 μl BrdU-Stammlösung zu 10 ml Complete RPMI.
- DNase-Lösung
- Bereiten Sie 1 mg DNase/ml in DPBS vor.
- Färbe-Puffer
- Bereiten Sie 3 % hitzeinaktiviertes FCS und 0,09 % Natriumazid in DPBS vor.
- In der Materialliste finden Sie die Definitionen von Fixationspuffer, Permeabilisierungspuffer und Waschpuffer.
2. Zellen
HINWEIS: Die Zellen wurden länger als 6 Monate nicht kultiviert. Diese Methode kann direkt an jede nicht adhärente Zelllinie angepasst werden, wobei die Zelldichte und die Kulturmedien angepasst werden. Verwenden Sie Zellen, die zu Beginn des Experiments exponentiell wachsen.
- Bewahren Sie NALM6-Zellen in T-75-Kulturflaschen in Complete RPMI auf. Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen mit einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II durch.
- Halten Sie NALM6-Zellen zwischen 1-2 x 106 Zellen pro ml, indem Sie die Kultur dreimal wöchentlich teilen.
- Inkubieren bei 37 °C in 5 % CO2 an der Luft.
3. Impulsmarkierung von Zellen mit BrdU
VORSICHT: Gehen Sie vorsichtig mit BrdU um, da es ein potentielles Mutagen und Teratogen ist.
- Zellen bei 150 x g für 5 min.
zentrifugieren
Anmerkung: Der Transfer von Zellen in frische Medien verbessert die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse.
- Führen Sie eine Zellzählung durch und resuspendieren Sie die Zellen in Complete RPMI bei 2 x 106 Zellen/ml.
- Verdünnen Sie die Zellen 1 zu 2 mit BrdU Complete RPMI, um eine endgültige Zellkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml zu erhalten.
- Bei 37 °C mit 5 % CO2 45 min inkubieren, dann die Zellen 1 zu 10 mit vollständiger RPMI verdünnen. Zellen bei 150 x g für 5 min zentrifugieren und den gesamten Überstand vorsichtig entsorgen.
- Resuspendieren Sie die Zellen in einem kleinen Volumen (~100 μl) mit vollständigem RPMI, führen Sie eine Zellzählung durch und stellen Sie sie auf 1 x 106 Zellen/ml ein.
- Pipettieren Sie 1 ml Zellen in die Vertiefungen einer 48-Well-Platte. Pipettieren Sie 1 ml DPBS in unbesetzte Vertiefungen, um reproduzierbarere Ergebnisse zu erzielen.
- Inkubieren bei 37 °C in 5 % CO2 in Luft für die gewünschten Zeitpunkte, hier 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 und 24 Std.
Anmerkung: Die Dauer hängt davon ab, was mit dem Versuchsdesign gemessen werden soll.
- Übertragen Sie alle Zellen mit einer Pipette in FACS-Röhrchen. Spülen Sie die Vertiefung nacheinander mit 1 ml PBS bis zu einem endgültigen Gesamtvolumen von 5 ml.
- Bei 150 x g 5 min zentrifugieren und vorsichtig den gesamten Überstand entfernen. Die Zellen sind bereit für die Färbung, führen Sie diese (Abschnitt 4) sofort durch.
4. Zellfärbung
HINWEIS: Wenn eine Oberflächenfärbung der Zellen erforderlich ist, führen Sie diese vor der Fixierung durch und stellen Sie sicher, dass die Zellen durchgehend bei 4 °C gehalten werden.
- Die Zellen werden in 100 μl Färbepuffer resuspendiert (für eine optionale Oberflächenfärbung das empfohlene Antikörpervolumen zu Oberflächenantigenen hinzufügen und 30 Minuten bei 4 °C inkubieren).
- 1 ml Färbepuffer zugeben, 5 min bei 150 x g zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
Hinweis: Der spezifische Antikörper, die Konzentration, die Inkubationszeit usw. variieren je nach den spezifischen experimentellen Zielen.