BrdU-Immunfluoreszenzfärbung: Eine Technik zur Identifizierung von Zellen in verschiedenen Phasen des Zellzyklus

Zusammenfassung

Quelle: Welschinger, R., et al. Zeitliche Verfolgung des Zellzyklusverlaufs mittels Durchflusszytometrie ohne die Notwendigkeit einer Synchronisation. J. Vis. Exp. (2015).

Dieses Video beschreibt das Protokoll für die BrdU-Immunfluoreszenzfärbung. Die Technik ermöglicht die Identifizierung von Zellen in verschiedenen Phasen des Zellzyklus. Die Zugabe von DNA-Farbstoffen und die Markierung von Antikörpern ermöglichen eine detaillierte Analyse des Verbleibs der Zellen der S-Phase zu einem späteren Zeitpunkt.

Protokoll

1. Lösungen und Reagenzien

1. Vollständiges RPMI
   1. Geben Sie 56 ml fötales Kälberserum (FCS) und 5,5 ml 200 mM L-Glutamin in eine 500 ml Flasche RPMI-1640 Medium.
2. DNase-Lösung
   1. Bereiten Sie 1 mg DNase/ml in DPBS vor.
3. Färbe-Puffer
   1. Bereiten Sie 3 % hitzeinaktiviertes FCS und 0,09 % Natriumazid in DPBS vor.
4. In der Materialliste finden Sie die Definitionen von Fixationspuffer, Permeabilisierungspuffer und Waschpuffer.

2. Zellfärbung

HINWEIS: Wenn eine Oberflächenfärbung der Zellen erforderlich ist, führen Sie diese vor der Fixierung durch und stellen Sie sicher, dass die Zellen durchgehend bei 4 °C gehalten werden.

1. Die Zellen werden in 100 μl Färbepuffer resuspendiert (für eine optionale Oberflächenfärbung das empfohlene Antikörpervolumen zu Oberflächenantigenen hinzufügen und 30 Minuten bei 4 °C inkubieren).
2. 1 ml Färbepuffer zugeben, 5 min bei 150 x g zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
   Anmerkung: Der spezifische Antikörper, die Konzentration, die Inkubationszeit usw. variieren je nach den spezifischen experimentellen Zielen.
3. Fixierung und Permeabilisierung
   1. Die Zellen werden in 100 μl Fixierungspuffer resuspendiert und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
   2. 1 ml Waschpuffer zugeben, 5 min bei 150 x g zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
   3. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl Permeabilisierungspuffer und inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang auf Eis.
   4. 1 ml Waschpuffer zugeben, 5 min bei 150 x g zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
   5. Die Zellen werden in 100 μl Fixierungspuffer pro Röhrchen resuspendiert und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
   6. 1 ml Waschpuffer zugeben, 5 min bei 150 x g zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier bei Bedarf pausiert werden. Die fixierten Zellen sind mehrere Tage bei 4 °C stabil, wenn sie in Färbepuffer resuspendiert werden. Entfernen Sie den Färbepuffer nach der Zentrifugation, bevor Sie fortfahren.
4. DNase-Behandlung
   1. Die Zellen werden in 100 μl DNase-Lösung (30 μg DNase/10⁶ Zellen) resuspendiert und die Zellen 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert.
   2. 1 ml Waschpuffer zugeben, 5 min bei 150 x g zentrifugieren und Überstand verwerfen.
5. Färbung von Antikörpern
   HINWEIS: Die Färbung für andere intrazelluläre Marker als BrdU kann gleichzeitig mit der BrdU-Färbung durchgeführt werden.
   1. WICHTIG: Bereiten Sie Kompensationskontrollen vor, die aus ungefärbten Zellen und Zellen bestehen, die mit jedem einzelnen Fluorochrom markiert sind. Im Idealfall verwenden Sie für die Kompensationskontrolle die gleichen Antikörper wie in den Versuchsröhrchen. Wenn dies jedoch nicht möglich ist, ersetzen Sie Antikörper durch Antikörper gegen stark exprimierte Antigene, die an dasselbe Fluorochrom konjugiert sind.
   2. Resuspendieren Sie die Zellen in 50 μl Waschpuffer und fügen Sie 1 μl/10⁶ Zellen BrdU-Antikörper hinzu.
      HINWEIS: Direkt konjugierte Antikörper gegen andere spezifische intrazelluläre Antigene können ebenfalls hinzugefügt werden.
      Anmerkung: Antikörper gegen Histon H3, phosphoryliert an Ser10, können zur Unterscheidung zwischen Zellen in G2 und M verwendet werden, Histon H3 wird während der Mitose an Ser10 phosphoryliert. Antikörper gegen cdc2, die auf Tyr15 phosphoryliert sind, können zum Nachweis von Zellen verwendet werden, die sich zur Mitose verpflichtet haben.
   3. Inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.
   4. 1 ml Waschpuffer zugeben, Zellen bei 150 x g für 5 min zentrifugieren und Überstand verwerfen.

6. Färbe-DNA für die Zellzyklusanalyse
   1. Pellet auflockern und 20 μl der 7-AAD-Lösung (0,25 μg) zugeben.
      HINWEIS: Es ist wichtig, eine konstante Menge an 7-AAD/Zelle zu verwenden.
   2. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Färbepuffer.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
APC BrdU Durchfluss-Kit	BD Biowissenschaften	552598	Enthält BrdU-Antikörper, 7-AAD und BD Cytofix/Cytoperm Puffer (als Fixierungspuffer bezeichnet)
BD Dauerwellen-/Waschpuffer	BD Biowissenschaften	554723	Bezeichnet als Waschpuffer
BD Pharmingen Fleckenpuffer	BD Biowissenschaften	554656
Pipetman	Gilson	P2, P20, P100, P1000
DNase	Sigma	Nr. D-4513
BD Cytoperm Permeabilization Puffer Plus	BD Biowissenschaften	561651	Bezeichnet als Permeabilisierungspuffer
Zentrifuge	Spintron	GT-175R
AF488 anti-Histon H3 Phospho (Ser10) Antikörper	Zelluläre Signalübertragung	9708S
Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Kaninchen mAb	Zelluläre Signalübertragung	2197S
Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Kaninchen mAb	Zelluläre Signalübertragung	2348S
BD Falcon 12 x 75 mm FACS Rohre	BD Biowissenschaften	352008