2D-Co-Kultur von leukämischen Zellen mit BMSCs: Eine Methode zur Gewinnung von Subpopulationen leukämischer Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Slone, W. L. et al. Modellierung von Chemotherapie-resistenter Leukämie in vitro. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video beschreibt die Technik für die langfristige 2D-Co-Kultur von Leukämiezellen mit Knochenmarkstromazellen, um ihre Interaktion mit der Mikroumgebung des Knochenmarks zu untersuchen. Das 2D-Kokulturmodell nutzt die akuten lymphatischen Leukämiezellen und die Stroma- oder Osteoblasten des Knochenmarks, die den Phänotyp der Tumorzellen beeinflussen. Diese Studie wird die Untersuchung der Mechanismen unterstützen, die dem knochenmarkgestützten Überleben von Leukämiezellen während der Chemotherapie-Exposition zugrunde liegen.

Protokoll

1. Fortgeschrittene Vorbereitung

1. Kultivierung von Knochenmarkstromazellen (BMSC) und Osteoblasten (OB).
   1. Sowohl BMSC als auch OB bei 37 °C in 6 % CO₂ halten und auf 10 cm Gewebekulturplatten züchten, bis eine Konfluenz von 90 % erreicht ist.
   2. Trypsinisieren Sie BMSC- oder OB-Zellen und spalten Sie sie 1:2 auf neue 10 cm große Platten. Die Zellen werden nach diesen Standards gezüchtet, bis sie für die leukämische Co-Kultivierung benötigt werden.

2. Etablierung und Pflege der Co-Kultur

1. Geben Sie 5-20 x 10⁶ leukämische Zellen in 10 ml tumorspezifischem Nährmedium auf eine zu 80%-90% konfluente BMSC- oder OB-Platte.
   HINWEIS: Unser Labor hält Co-Kulturen bei 37 °C in 5 % O₂ aufrecht, um die Mikroumgebung des Knochenmarks besser rekapitulieren zu können, die nachweislich zwischen 1 % und 7 % liegt. Die Aufrechterhaltung von Co-Kulturen bei dieser Sauerstoffspannung ist jedoch nicht entscheidend für die Etablierung der drei leukämischen Subpopulationen und liegt im Ermessen des Labors.
2. Entfernen Sie jeden 4^. Tag alle bis auf 1 ml des Mediums (einschließlich Leukämiezellen in Suspension) und ersetzen Sie es durch 9 ml frisches Leukämie-Kulturmedium. Achten Sie beim Entfernen von 9 ml Medium aus der Platte darauf, die Adhärentschicht der Knochenmarkstromazellen (BMSC) oder Osteoblasten (OB) nicht zu stören.
   1. Entfernen Sie das Medium, indem Sie die Platte zur Seite kippen und das Medium in der Ecke der Platte ansaugen. Achten Sie außerdem beim Hinzufügen von frischem Medium darauf, dass die Platte tropfenweise in der Ecke der Platte gegen die Seitenwand aufgetragen wird, um eine minimale Störung der BMSC- oder OB-Haftschicht zu gewährleisten.
3. Nach dem 12^. Tag der Co-Kultur spülen Sie Leukämiezellen aus der BMSC- oder OB-Schicht, indem Sie das Kulturmedium etwa 5 bis 10 Mal vorsichtig von der Schale auf und ab über die Schale pipettieren und dann in einem konischen 15-ml-Röhrchen auffangen. Nachsaat auf eine neue 80%-90% konfluente BMSC- oder OB-Platte, wie in Schritt 2.1.
   beschrieben HINWEIS: Durch das sanfte Spülen der Co-Kultur, wie in Schritt 2.3 beschrieben, werden suspendierte und phasenhelle leukämische Zellen entfernt, ohne die BMSC- oder OB-Monoschicht zu stören. Dadurch können nur Tumorzellen auf die nächste Co-Kulturplatte übertragen werden. Dieser 12-Tage-Zyklus kann je nach Benutzerbedarf so oft wie nötig wiederholt werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
100 x 20 mm Zellkulturschalen	Greiner Bio-One	Artikel-Nr.: 664160
15 ml konische Zentrifugenröhrchen	Weltweite Medizinprodukte	41021037	Wird für die Zellentnahme verwendet
Kulturmedien
Osteoblasten-Nährmedien	PromoCell	Nr. C-27001	Für humane Osteoblastenmedien
RPMI 1640 Medien	Mediatech, Inc.	Nr. 15-040	Für die Vorbereitung von Tumormedien
Adhärente Zellen
Menschliche Osteoblasten	PromoCell	Nr. C-12720	Humane Osteoblasten wurden gemäß den Empfehlungen des Lieferanten kultiviert.
Menschliche Knochen Morrow Stromazellen	WVU Bioproben-Kern		Die anonymisierten primären menschlichen Leukämie- und Knochenmarkstromazellen (BMSC) wurden vom Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core und der West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank zur Verfügung gestellt
Leukämische Zellen
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	REH-Zellen wurden gemäß den Empfehlungen des Lieferanten und den empfohlenen Medien kultiviert.
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 wurden gemäß den Empfehlungen des Lieferanten und den empfohlenen Medien kultiviert.