Leukämische Subpopulationsernte: Eine Methode zur räumlichen Trennung von leukämischen Zellsubpopulationen aus 2D-Cokulturen

Abstract

Quelle: Slone, W. L., et al. Modellierung von Chemotherapie-resistenter Leukämie in vitro. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video beschreibt eine Methode zur räumlichen Trennung von drei leukämischen Zellsubpopulationen: die schwebenden leukämischen Zellen, die frei in den Medien schweben, phasenhelle leukämische Zellen, die an der Oberfläche der mesenchymalen Stromazell-Monoschicht haften, und die phasenschwachen Leukämiezellen, die unter die mesenchymale Stromazell-Monoschicht aus der 2D-Co-Kultur gewandert sind.

Protocol

1. Trennung von 3 Subpopulationen innerhalb der Co-Kultur

1. Sammlung von Suspensionstumoren (S) Subpopulationen.
   1. Aspirieren Sie das Medium mit einer Pipette aus der Co-Kulturplatte und tragen Sie das gleiche Medium vorsichtig erneut auf, um die Platte zu spülen und das Medium mit leukämischen Zellen in einem konischen 15-ml-Röhrchen zu sammeln. Die gesammelten leukämischen Zellen sind die S-Subpopulation.
2. Sammlung von Phase Bright (PB) Tumorsubpopulationen.
   1. 10 ml frisches Medium wieder auf die Co-Kulturplatte geben. Spülen Sie kräftig nach, indem Sie das hinzugefügte Medium etwa 5 Mal auf und ab pipettieren, um adhärente Leukämiezellen zu entfernen, aber nicht fest genug, um die adhärente BMSC/OB-Komponente zu entfernen.
   2. Mit einer Pipette aspirieren und das Medium in einem konischen 15-ml-Röhrchen auffangen. Die gesammelten Zellen sind die PB-Subpopulation.
3. Sammlung von Phase-Dim-Tumorsubpopulationen (PD).
   1. Spülen Sie die Platte mit 1 ml PBS aus, um das restliche Medium zu entfernen. Die Co-Kulturplatte mit 3 ml Trypsin trypsinisieren und für 5 min in den 37 °C heißen Inkubator stellen.
   2. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und klopfen Sie vorsichtig auf die Seiten der Platte, um anhaftendes BMSC/OB zu entfernen.
   3. Fügen Sie 1 ml fötales Rinderserum (FBS) hinzu und pipettieren Sie 3-5 Mal auf und ab, um große Zellaggregate aufzubrechen.
   4. Sammeln Sie das Medium mit den Zellen in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Diese Zellen sind auch die ungereinigte PD-Subpopulation mit BMSC/OB.
4. 3 isolierte Subpopulationen bei 400 x g für 7 min zentrifugieren. Überstand aspirieren und verwerfen, dann die Pellets einzeln in 1 ml vorgewärmtem Medium resuspendieren. Die Zellen können in eine G10-Spalte geladen werden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 ml konische Zentrifugenröhrchen	Weltweite Medizinprodukte	41021039	Konservierungslösung für Zytologie-Proben
15 ml konische Zentrifugenröhrchen	Novacyt	Na	Wird für die Zellentnahme verwendet
Fötales Rinderserum	Sigma	Nr. F6178
0,05% Trypsin	Mediatech, Inc	5229 TEC 5	25-053-CI
100 x 20 mm Zellkulturschalen	Greiner Bio-One	Artikel-Nr.: 664160
Kulturmedien
Osteoblasten-Nährmedien	PromoCell	Nr. C-27001	Für humane Osteoblastenmedien
RPMI 1640 Medien	Mediatech, Inc.	Nr. 15-040	Für die Vorbereitung von Tumormedien
Zelllinien
Menschliche Osteoblasten	PromoCell	Nr. C-12720	Humane Osteoblasten wurden gemäß den Empfehlungen des Lieferanten kultiviert.
Menschliche Knochen Morrow Stromazellen	WVU Bioproben-Kern		Die anonymisierten primären menschlichen Leukämie- und Knochenmarkstromazellen (BMSC) wurden vom Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core und der West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank zur Verfügung gestellt. BMSC-Kulturen wurden wie zuvor beschrieben etabliert (*)
Leukämische Zellen
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	REH-Zellen wurden gemäß den Empfehlungen des Lieferanten und den empfohlenen Medien kultiviert.
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 wurden gemäß den Empfehlungen des Lieferanten und den empfohlenen Medien kultiviert.