G-10-säulenbasierte Sortierung von Leukämiezellen: Eine Methode zur Aufreinigung von akuten lymphatischen Leukämiezellen aus Stromazellen des Knochenmarks

Abstract

Quelle: Slone, W. L., et al. Modellierung von Chemotherapie-resistenter Leukämie in vitro. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video beschreibt die Trennung von akuten lymphatischen Leukämiezellen von Knochenmarkstromazellen mit Hilfe von gelartigen, zehnfach vernetzten Dextran G-10-Säulen. Diese Methode hilft dabei, die Population von Tumorzellen wiederherzustellen, die unter die adhärenten Knochenmarkstromazellen gewandert sind, wodurch eine "Phase Dim"-Tumorzellpopulation entsteht.

Protocol

>1. Laden von Co-Kulturzellen auf die G10-Säule

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Absperrhahn vollständig geschlossen ist, bevor Sie Medien mit Zellen zur Spalte G10 hinzufügen. Außerdem muss jede Teilpopulation über eine separate G10-Spalte ausgeführt werden, um keine Verzerrung zwischen den Grundgesamtheiten in der nachgelagerten Analyse zu verursachen.

1. Geben Sie mit einer 1.000-μl-Pipette 1 ml jeder Zellsubpopulation in vorgewärmtem Medium tropfenweise in eine separate G10-Säule. Stellen Sie sicher, dass das Medium, das die Zellen enthält, auf oder innerhalb des G10-Pellets verbleibt. Lassen Sie die Zellen 20 Minuten lang bei RT.
   auf G10-Pellet inkubieren. Anmerkung: Der Absperrhahn bleibt für die Dauer der Inkubation geschlossen.

>2. Sammeln von leukämischen Zellen aus der G10-Säule

1. Geben Sie 1-3 ml vorgewärmtes Medium in jede G10-Spalte. Öffnen Sie das Absperrhahnventil und lassen Sie das Medium langsam tropfenweise aus der Säule austreten.
   Anmerkung: Es ist entscheidend, eine langsame Flussrate aus der Säule aufrechtzuerhalten, da sonst das G10-Pellet, das BMSC/OB enthält, aus der Säule ausgewaschen und die isolierten Leukämiezellen kontaminieren kann.
2. Geben Sie weiterhin vorgewärmtes Medium in kleinen Schritten (1-2 ml) in die G10-Säule, bis insgesamt 15 bis 20 ml durch die Säule gelaufen und aufgefangen wurden. Absperrhahnventil und Kappenauffangrohr schließen.
   Anmerkung: Wenn ein G10-Partikelpellet am Boden des Auffangrohrs zu sehen ist, entfernen Sie vorsichtig das Medium aus dem Rohr, lassen Sie das G10-Partikelpellet ungestört und geben Sie es in ein neues Rohr.
3. Das gesammelte Medium wird bei 400 x g für 7 min bei RT zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Zellpellet wird in einem für die nachgeschaltete Anwendung geeigneten Puffer resuspendiert.
4. Die Zellen sind jetzt eine reine Population von Leukämiezellen, die frei von BMSC- oder OB-Kontamination sind und nach Ermessen des Benutzers in nachgelagerten Anwendungen eingesetzt werden können.
   HINWEIS: Die Lebensfähigkeit leukämischer Zellen sollte unverändert bleiben, wenn Zellen durch G10-Säulen geleitet werden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
G10 Sephadex Kügelchen	Sigma	Nr. G10120	Im Manuskript als vernetzte Dextranpartikel vom Geltyp 10 bezeichnet
10 ml sterile Spritze	Bd	309604
1-Wege-Absperrhähne	World Precision Instruments, Inc.	Nr. 14054-10
Menschliche Osteoblasten	PromoCell	Nr. C-12720	Humane Osteoblasten wurden gemäß den Empfehlungen des Lieferanten kultiviert.
Menschliche Knochen Morrow Stromazellen	WVU Bioproben-Kern		Die anonymisierten primären menschlichen Leukämie- und Knochenmarkstromazellen (BMSC) wurden vom Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core und der West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank zur Verfügung gestellt. BMSC-Kulturen wurden wie zuvor beschrieben etabliert (*)
0,05% Trypsin	Mediatech, Inc.	25-053-CI
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	REH-Zellen wurden gemäß den Empfehlungen des Lieferanten und den empfohlenen Medien kultiviert
Glaswolle	Pyrex	Artikel-Nr.: 3950
50 ml konische Zentrifugenröhrchen	Weltweite Medizinprodukte	41021039	Wird als Auffangröhrchen verwendet
15 ml konische Zentrifugenröhrchen	Weltweite Medizinprodukte	41021037	Wird für die Zellentnahme verwendet
Fötales Rinderserum	Sigma	Nr. F6178
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 wurden gemäß den Empfehlungen des Lieferanten und den empfohlenen Medien kultiviert
100 x 20 mm Zellkulturschalen	Greiner Bio-One	Artikel-Nr.: 664160