Retroorbitale Blutentnahme: Eine Methode zur Isolierung mononukleärer Zellen aus dem retroorbitalen Sinus einer Maus

Zusammenfassung

Quelle: Mopin A. et al. Ein detailliertes Protokoll zur Charakterisierung der murinen C1498-Zelllinie und des zugehörigen Leukämie-Mausmodells. J. Vis. Exp. (2016)

Das Video beschreibt eine Probenahmemethode für die periphere Blutentnahme aus dem retroorbitalen Sinus einer Maus und die weitere Isolierung von mononukleären Zellen aus Blut mit Dichtegradientenzentrifugation.

Protokoll

>1. Retroorbitale Blutentnahme

1. Führen Sie kurz vor der Euthanasie unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube und unter einer Heizlampe eine retroorbitale Blutentnahme durch, um eine Unterkühlung zu verhindern.
2. Zur Anästhesie verwenden Sie Ketamin in einer Menge von 150 mg/kg und Xylazin in einer Menge von 10 mg/kg. Bereiten Sie die Anästhesielösung vor, indem Sie 1,5 ml Ketamin und 0,5 ml Xylazin in 18 ml PBS-Lösung verdünnen.
3. Führen Sie einen Kapillarschlauch in den medialen Canthus des Auges ein. Das Blut steigt aus der Orbitalhöhle in die Kapillarröhre auf. Kontrollieren Sie die Blutung, indem Sie mit einem sterilen Mullschwamm sanften Druck auf das Auge ausüben.
   Anmerkung: Mit dieser Technik kann ein Volumen von 100 bis 200 μl Blut entnommen werden.
4. Sammeln Sie das Blut in ein EDTA-Röhrchen und lagern Sie die Probe auf Eis, bevor Sie die mononukleären Zellen isolieren.

>2. Isolierung von mononukleären Blutzellen

1. Die Blutprobe (100 bis 200 μl; aus Schritt 1.1) wird in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und PBS/1 mM EDTA-Lösung zugegeben, bis das Lösungsvolumen 500 μl beträgt. 500 μl Trennlösung mit einer 30-G-Nadel und einer 1-ml-Spritze vorsichtig unter die blutenthaltende Lösung schichten. Mischen Sie nicht das Blut und die Trennlösung.
2. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 800 x g (ohne Bremse) für 20 min bei RT. Nach der Zentrifugation den Zellring (die undurchsichtige weiße Schicht) mit einer Pipette sammeln. Übertragen Sie die Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
   Anmerkung: Die undurchsichtige weiße Schicht enthält sowohl Lymphozyten als auch Monozyten und entsteht zwischen der unteren Schicht - der Trennlösung - und der oberen Schicht.
3. Fügen Sie 1 ml PBS-Lösung hinzu und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 350 x g für 10 min. Resuspendieren Sie die Zellen in 600 μl FACS-Puffer.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ketamin 1000 (100 mg/ml)	VIRBAC	3.59713E+12
Xylazin SEDAXYLAN (20 mg/ml)	CEVA
PBS-Lösung (1x Konzentrat)	ThermoFisher Scientific	Artikel-Nr.: 14190
Ultrareine 0,5 M EDTA-Lösung, pH 8,0	ThermoFisher Scientific	Artikel-Nr.: 15575
Trennlösung (Pancoll Mouse)	PANBIOTECH	Tel. P04-64100
EDTA-Röhre	Greiner Bio-One	454034
Pasteurpipette 150 mm (Kapillarrohr)	Fisherbrand	Tel.: 1154-6963
Durchflusszytometrie-Röhrchen (blau)	Beckman Coulter	2523749
Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml)	ThermoFisher Scientific	Tel.: 05-408-129
Sterile Mullschwämme	URGO	Artikel-Nr.: 501580
30 G Nadel	Becton & Dickinson	Artikel-Nr.: 304000
1 ml Spritze	Terumo	SS-01T
Shandon Cytospin 3 Zytozentrifuge	ThermoFisher Scientific