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1. In vitro Charakterisierung der C1498 Zelllinie
- In-vitro-Kultur von C1498-Zellen
- Bereiten Sie das komplette RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640-Medium vor, indem Sie 50 ml fötales Rinderserum (FBS), 5 ml Penicillin (100 U/ml)-Streptomycin (100 μg/ml), 500 μl 50 mM β-Mercaptoethanol, 5 ml N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-Ethansulfonsäure (HEPES), 5 ml nicht-essentielle Aminosäuren und 5 ml Natriumpyruvat zu 500 ml RPMI-Medium hinzufügen.
- Züchten Sie die C1498-Zelllinie in vollständigem RPMI. Ernten Sie die Zellen in Suspension durch Pipettieren und geben Sie die Zellen in ein 50-ml-Röhrchen. Bei 350 x g 10 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.
- 20 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (1x) zugeben, 10 min bei 350 x g zentrifugieren und den Überstand entfernen.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml Fluoreszenz-aktiviertem Zellsortierer (FACs)-Puffer (2,5 g Rinderserumalbumin (BSA)-Pulver und 2 ml 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung in 500 ml PBS-Lösung). Zählen Sie die Zellen mit einer Thoma-Zellzählkammer, nachdem Sie die Zellen mit Trypanblau gefärbt haben.
2. Herstellung einer Zellsuspension auf Objektträgern für die Mikroskopie
- 106 der geernteten C1498-Zellen (die in Schritt 1.1.4 gewonnen wurden) werden zweimal mit 5 ml kaltem FAC-Puffer gewaschen und die Zellen mit 1 ml kaltem FAC-Puffer verdünnt. Lege die Röhren auf Eis.
- Legen Sie Objektträger in Einwegkammern mit vorangebrachten Filterkarten und legen Sie diese in eine Zytozentrifuge.
- Geben Sie 100 μl FAC-Puffer in jede Kammer und Filterkarte und drehen Sie sie 2 Minuten lang bei 4,52 x g.
- Geben Sie 100 μl Zellen in jede Kammer und Filterkarte und drehen Sie die Zellen 2 Minuten lang bei 4,52 x g.
- Nehmen Sie die Objektträger vorsichtig aus den Kammern und trocknen Sie sie an der Luft, bevor Sie sie mit May-Grünwald Giemsa Beize färben.
3. May-Grünwald Giemsa (MGG) Färbung
- Die Zellen (vorbereitet in Abschnitt 2) färben, indem die Objektträger 3 Minuten lang in ein Coplin-Glas mit May-Grünwald-Lösung getaucht werden.
- Übertragen Sie die Objektträger für 1 min in ein Coplin-Glas mit der Pufferlösung pH 6,8.
- Färben Sie die Objektträger, indem Sie sie 10 Minuten lang in ein Coplin-Glas geben, das die Giemsa R-Lösung (verdünnt auf 1/20 in einer Pufferlösung von pH 6,8) enthält. Waschen Sie die Objektträger 10 Sekunden lang mit neutralem Wasser (pH 7).
- Lassen Sie die Objektträger abtropfen und trocknen Sie sie an der Luft. Montieren Sie die Objektträger, indem Sie einen Tropfen Eindeckmedium 2 auf die Zellen auftragen. Legen Sie eine Kante des Deckglases auf den Objektträger und senken Sie es vorsichtig mit einer Pinzette auf die Zellen ab. Drücken Sie vorsichtig auf das Deckglas, um eventuelle Luftblasen zu entfernen.