Dichtegradientenzentrifugation: Eine Methode zur Isolierung von CLL-Zellen aus peripherem Blut

Abstract

Quelle: Hay, J. et al. Subzelluläre Fraktionierung von primären chronischen lymphatischen Leukämiezellen zur Überwachung des nuklearen/zytoplasmatischen Proteintransports. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video beschreibt die Technik zur Isolierung von Zellen der chronischen lymphatischen Leukämie (CLL) aus dem peripheren Blut. Mit diesem Protokoll werden wir CLL-Zellen aus Blutproben menschlicher Patienten isolieren, um anschließend effizient nukleare und zytoplasmatische Fraktionen zu erzeugen.

Protocol

1. Isolierung von CLL-Zellen aus Blutproben von Patienten

1. Periphere Blutproben von zuvor eingewilligten CLL-Patienten werden in EDTA-Blutentnahmeröhrchen von der Klinik entgegengenommen, begleitet von der Anzahl der weißen Blutkörperchen (WCC). Reinigen Sie die CLL-Proben des peripheren Blutes gemäß dem ÖRK. Für WCC-< 40 x 10⁶ Zellen/ml fahren Sie mit Schritt 1.1.1 fort. Für WCC ≥ 40 x 10⁶ Zellen/ml fahren Sie mit Schritt 1.1.2 fort.
   1. Gießen Sie den Inhalt aller EDTA-Blutröhrchen in ein konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 50 μl humanen B-Zell-Anreicherungscocktail pro 1 ml Blut hinzu. Bei Raumtemperatur (RT) 20 min inkubieren. Fahren Sie mit Schritt 1.1.2 fort.
   2. Verdünnen Sie die Probe im Verhältnis 1:1 mit RT CLL-Waschpuffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 0,5 % fötales Rinderserum (FBS) und 2 mM EDTA).
2. Aliquotieren Sie das RT-Dichtegradientenmedium in ein konisches Zentrifugenröhrchen geeigneter Größe für die Probe (10 mL in ein 50 mL-Röhrchen für 30 mL Probe oder 4 mL in ein 15 mL Röhrchen für 10 mL Probe).
3. Die Probe vorsichtig auf das Dichtegradientenmedium schichten und 30 min bei RT.
   bei 400 x g zentrifugieren HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Zentrifuge auf RT befindet, bevor die Proben in die Zentrifuge gegeben werden, da eine Temperaturänderung zu einer schlechten Anreicherung der mononukleären Zellen führt, und schalten Sie die Bremse an der Zentrifuge aus, da ein plötzliches Bremsen die Flüssigkeitsgrenzfläche stören kann.
4. Ernten Sie die weiße Schicht der mononukleären Zellen, die sich an der Grenzfläche zwischen dem Dichtegradientenmedium und dem CLL-Waschpuffer ansammeln, vorsichtig mit einer Pasteur-Kunststoffpipette in ein frisches konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
5. Geben Sie 40 mL CLL-Waschpuffer in die isolierte Monoschicht, um die Zellen zu waschen, und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei RT bei 300 x g.
6. Entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie mit dem Boden des Rohrs schnippen, und wiederholen Sie dann den in Schritt 1.5 beschriebenen Waschschritt.
7. Entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet wie in Schritt 1.6 beschrieben und resuspendieren Sie das Pellet dann in einem festgelegten Volumen CLL-Waschpuffer (bis zu 40 ml, abhängig von der Größe des Zellpellets).
8. Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau und einem Hämozytometer. Fahren Sie dann mit der Durchflusszytometrie fort, um die Reinheit der CLL-Zellen zu überprüfen.
   HINWEIS: In diesem Stadium können die CLL-Zellen in einer Konzentration von 10 x 10⁶ Zellen/ml in Medien kultiviert werden, die in Experimenten verwendet werden können, und/oder in 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO)/FBS für zukünftige Arbeiten bei Konzentrationen von bis zu 100 x 10⁶ Zellen/Fläschchen kryokonserviert werden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Röhrchen	Griener Bio one	188271
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Griener Bio one	616201
Dmso	Sigma	Nr. D2650
Edta	Sigma	Eds
Fötales Rinderserum	Thermofischer	10500064
Histopaque1077 Dichtegradienten-Medien	Sigma	Nr. H8889
Trypanblau-Lösung	Thermofischer	15250061
PBS-Tabletten	Fisher Scientific	BR0014G
RosetteSep Cocktail zur Anreicherung menschlicher B-Zellen	Technologien für Stammzellen	Artikel-Nr.: 15064
Sigma 3-16P	SciQuip (Englisch)		Zentrifuge