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1. Präparation subzellulärer Fraktionen aus CLL-Zellen
HINWEIS: Bei der Planung des Versuchsaufbaus ist eine Vertiefung mit unstimulierten/unbehandelten Zellen zu berücksichtigen, aus der der gesamte Zellextrakt erzeugt werden kann.
- Führen Sie die gewünschte Stimulation und/oder medikamentöse Behandlung der MEC1-CLL-Zelllinie oder isolierter primärer CLL-Zellen mit 10 – 20 x 106 Zellen/Zustand durch. Die Zellen werden dann für die subzelluläre Fraktionierung oder zur Erzeugung von Ganzzellextrakt verwendet, wie unten erläutert:
- Vorbereitung der Lösungen/Röhrchen: Bereiten Sie alle Lösungen/Puffer am Tag der Fraktionierung frisch vor, bevor die Zellen geerntet werden. Lagern Sie die Lösungen bis zur Verwendung auf Eis und verwenden Sie sie innerhalb von 4 Stunden nach der Zubereitung.
- PBS/Phosphatase-Inhibitor-Lösung: Bereiten Sie die Phosphatase-Inhibitoren in PBS vor, indem Sie die Phosphatase-Inhibitoren 1:20 in 1x PBS verdünnen (d.h. 0,5 mL Phosphatase-Inhibitoren in 9,5 mL 1x PBS).
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass die Phosphatasehemmer nicht ausgefällt wurden. Wenn ein Niederschlag vorhanden ist, 10 min auf 50 °C erhitzen.
- Hypotoner Puffer: Bereiten Sie 1x hypotonen Puffer vor, indem Sie eine 1:10-Verdünnung von 10x hypotonischem Puffer in destilliertem Wasser vornehmen (d.h. 50 μl 10x hypotonischer Puffer in 450 μ l dH2O).
- 10 mM Dithiothreitol (DTT): 10 mM DTT wird durch eine Verdünnung von 1:100 von 1 M DTT mit destilliertem Wasser hergestellt (d. h. 10 μl 1 M DTT in 990 μl dH2O).
Anmerkung: DVB-T ist sehr labil, also bereiten Sie es jedes Mal frisch zu. Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-/Auftauzyklen.
- Vollständiger Lysepuffer: Bestimmen Sie, wie viel Puffer für jedes Experiment benötigt wird. Jede Probe benötigt 50 μl vollständigen Lysepuffer, fügen Sie also 5 μl 10 mM DTT zu 44,5 μl Lysepuffer hinzu und fügen Sie dann 0,5 μl Proteaseinhibitor-Cocktail hinzu. Diese Menge kann je nach Anzahl der Proben im Experiment hochskaliert werden.
- Markieren Sie vier Sätze von 1,5-ml-Mikrofuge-Röhrchen für jede Stimulation und/oder medikamentöse Behandlung für die frisch stimulierten Zellen, die frisch erzeugten zytoplasmatischen Fraktionen, die frisch erzeugten Kernfraktionen und die Lysate der gesamten Zelle. Kühlen Sie diese Mikrofuge-Röhrchen bis zur Verwendung auf Eis vor.
- Übertragen Sie die Zellen in einzeln markierte 1,5 mL Mikrofuge-Röhrchen und pelletieren Sie, indem Sie sie 5 Minuten lang bei 4 °C bei 200 x g zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 mL eiskalten PBS/Phosphatase-Inhibitoren. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 200 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und halten Sie die Zellpellets auf Eis.
- Vorbereitung der zytoplasmatischen Fraktionen: Die Zellpellets, die für die subzelluläre Fraktionierung verwendet werden sollen, in 50 μl 1x hypotonischem Puffer vorsichtig resuspendieren. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang auf Eis, damit die Zellen aufquellen können.
Anmerkung: Das Volumen des verwendeten hypotonen Puffers kann empirisch in Abhängigkeit von der Zellzahl erhöht werden.
- Geben Sie 0,8 - 2,5 μl (1:20 bis 1:60) Reinigungsmittel in jede Probe und wirbeln Sie sie 10 s lang auf höchster Stufe ein.
- Um die optimale Konzentration des Detergens zu bestimmen, das für einen bestimmten Zelltyp zur Isolierung von nuklearen und zytoplasmatischen Fraktionen verwendet werden soll, führen Sie zunächst einen Detergenziengradienten durch. Ein Bereich von 1:20 bis 1:60 (d. h. 2,5 μl bis 0,8 μl Detergens in 50 μl hypotonischer Puffer) sollte ausreichend sein.
Anmerkung: Wenn das Volumen des hypotonen Puffers in Schritt 3.4 angepasst wird, ist sicherzustellen, dass das richtige Detergenzverhältnis beibehalten wird.
- Überprüfen Sie die Zelllyse, indem Sie die Zellen vor und nach der Zugabe von Detergens mit einem Phasenkontrastmikroskop beobachten. Ganze Zellen erscheinen größer mit einem dichten, dunklen Kern. Das Zytoplasma erscheint als heller Halo um den Zellkern.
Anmerkung: Die angemessene Lyse wird ferner durch die Verwendung von Western Blotting bestätigt, um spezifische Proteine innerhalb der lysierten Fraktionen zu analysieren, die aus dem Detergenzgradienten erzeugt werden.
- Nach der Lyse zentrifugieren Sie die Proben bei 14.000 x g für 30 s bei 4 °C.
- Den Überstand vorsichtig in ein vorgekühltes, beschriftetes Mikrofugenröhrchen umfüllen. Diese zytoplasmatische Fraktion kann bei -80 °C gelagert werden, bis sie für die weitere Analyse benötigt wird. Das verbleibende Pellet enthält die Kernfraktion.
Anmerkung: Vermeiden Sie wiederholte Einfrier-/Auftauzyklen der Proben.
- Aufbereitung der Kernfraktionen: Resuspendieren Sie jedes Kerngranulat in 50 μl vollständigem Lysepuffer durch Auf- und Abpipettieren.
HINWEIS: Das Volumen des vollständigen Lysepuffers kann empirisch entsprechend der Ausgangszellzahl eingestellt werden.
- Fügen Sie 2,5 μl Detergens hinzu, um Proteine, die mit der Kernmembran und dem Wirbel verbunden sind, auf höchster Stufe für 10 s zu lösen. Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang auf Eis.
Auf - höchster Stufe 30 s vortexen, dann die Proben bei 14.000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Den Überstand in ein vorgekühltes, beschriftetes Mikrofugenröhrchen überführen. Diese Kernfraktion kann bei -80 °C gelagert werden, bis sie für die weitere Analyse benötigt wird.
Anmerkung: Vermeiden Sie wiederholte Einfrier-/Auftauzyklen der Proben.